İÇİndekiler yeni teklif projeler

9.3 Materyal ve Metot:

9.3.1 Materyal

Bu çalışmanın hayvan materyalini Marmara Hayvancılık

araştırma Enstitüsü’nde yetiştiriciliği yapılan ve Ülkesel

Merinos Geliştirme Projesi kapsamında damızlık olarak

kullanılacak olan 100 baş Karacabey Merinosu koçu

oluşturacaktır. Her bir koçun vena jugularisinden

EDTA’lı tüpler içerisine alınacak olan 10’ar ml kan

örneği labaratuvar aşamasında kullanılıncaya kadar -20

0C’de muhafaza edilecektir.

9.3.2 Yöntem

9.3.2.1 DNA izolasyonu

Porjenin DNA ekstraksiyonu Enstitümüz Üreme ve

Biyoteknoloji laboratuvarında, diğer laboratuvar

aşamaları Yıldız Teknik Üniversitesi Biyoloji Bölümü

ve İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya

laboratuvarında gerçekleştirilecektir.

EDTA’lı tüplerdeki kan örnekleri çözdürüldükten sonra

Qiagen marka Q-51104 katalog numaralı Qiaamp DNA

Blood Mini kit kullanılarak DNA ekstraksiyonu

gerçekleştirilecektir. Bu işlem sırasında üretici firma

tarafından yayınlanan el kitabındaki spin protokol

yöntemi izlenecektir.

Bu yönteme göre DNA ekstraksiyonunda

izlenecek adımlar aşağıdaki gibidir:

1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpünün dibine 20 μl

QIAGEN proteaz (veya proteinaz K) konur.

1- Üzerine 200 μl tam kan ilave edilir.

2- 200 μl Buffer AL eklenir ve vorteksle 12 saniye karıştırılır.

3- 56°C de 10 dakika inkübe edilir.

4- Mikrosantrifüj tüpününü kapağının iç tarafındaki damlacıkları uzaklaştırmak için kısa

süreli santrifüj edilir.

Kodonlar

136 154 171

Scrapie

direnç

indeksi

(ABD)

AA RR QQ 3

AA RR QR 9

AA RR RR 13

AA RH QQ 3

AA RH QR 9

AA RH RR 13

AA HH QQ 3

AA HH QR 9

AA HH RR 13

AV RR QQ 1

AV RR QR 7

AV RR RR 11

AV RH QQ 1

AV RH QR 7

AV RH RR 11

AV HH QQ 1

AV HH QR 7

AV HH RR 11

VV RR QQ 0

VV RR QR 6

VV RR RR 10

VV RH QQ 0

VV RH QR 6

VV RH RR 10

VV HH QQ 0

VV HH QR 6

VV HH RR 10

34

5- Karışıma 200 μl etanol (96-100%) eklenir ve 15 saniye vorteksle karıştırılır sonra

tekrar kısa süreli santrifüjlenir.

6- 6. Adımdaki karışım 2ml lik tüplerdeki QIAamp mini spin kolonlara kenarlarını

ıslatmadan dikkatli dikkatlice aktarılır. Tüpler kapatılarak 8000 rpm hızda 1 dk

santrifüj edilir. Spin kolonlar 2ml’li temiz tüplere yerleştirilir ve filtrat içeren tüpler

atılır.

7- Spin kolonlar dikkatlice açılır ve tüpün kenarı ıslatılmadan 500 μl Buffer AW 1 ilave

edilir ve 8000 rpm hızda 1 dk santrifüj edilir. Spin kolonlar 2 ml’lik temiz tüplere

aktarılır ve filtrat içeren tüpler atılır.

8- Dikkatlice açılan spin kolonlara 500 μl Buffer AW 2 İlave edilir ve 14000rpm hızda 3

dk santrifülenir.

9- Spin kolonlar 1.5 ml’lik temiz tüplere aktarılır ve filtrat içeren tüpler atılır. Açılan

kolonlara 200 μl Buffer AE ya da disitile su eklenir, oda sıcaklığında (15-25°C) 1 dk

inkübe edilir ve 8000 rpm hızda santrifüj edilir.

10- Elde DNA örnekleri PCR aşamasına kadar -20°C de muhafaza edilir.

9.3.2.2 PCR İşlemi

Bu çalışmada PCR işlemiyle çoğaltılacak olan PrP kodlama bölgesi (Gen-Bank ulaşım numarası

AF195247 nükleotid 8-752’den) için kullanılan primer dizileri aşağıdaki şekilde dizayn

edilecektir:

Forward primer: 5’-AAAGCCACATAGGCAGTTG-3’

Reverse primer: 5’-AATGAGGAAAGAGATGAGGAG-3’

PCR işlemi, 25 μl’lik eppendorf tüplerde 3 μl (50-100 ng) genomik DNA, 14, 9 μl 1x Mg+2’ siz

reaksiyon bufferi, 2 μl MgCl2 (2,5 mM), her dNTP’den 0,1 μl, primerlerden 1 μl (10 μM) ve 0,2

μl 1U Taq polimeraz ile DNA Thermal Cycler 9700 (Applied Biosystems) cihazında

gerçekleştirilecektir. PCR çoğaltım işleminin koşulları 2 dakika 94 oC’de denatürasyon aşaması,

30 siklus boyunca 94 oC’de 1 dakika, 57 oC’de 1 dakika primer bağlanması, 72 oC’de 1 dakika

DNA uzaması aşaması ve son siklus sonunda 10 dakika 72 oC’de bekleme şeklinde olacaktır.

PCR ürünleri daha sonra %2’lik agaroz jelde 150 V’de 15 dk. yürütülerek uzun dalga boylu UV

cihazı kullanılarak görüntüleneceektir.

9.3.2.3 Sekans

Dizin analizi işlemleri, bölüm laboratuarında bir Sequencer cihazı bulunmaması nedeniyle İontek

şirketinden hizmet olarak alınacaktır. İontek şirketi dizin analizi sonucunda nükleotidlerin

okunabilirliğini 500bp ile 700bp arasında vermektedir. Bütün nükleotidlerin okunabilirliğini

garanti etmek için yaklaşık 800bp uzunluğundaki PrP genini kodlayan bölge hem sağdan hemde

soldan dizin analizine tabii tutulacaktır. Gen değişimi görülen örnekler, kontrol için ikinci kez

analiz edilecektir. İkinci analizler tercihen başka bir kuruma ve cihaza yaptırılacaktır

9.3.2.4 İstatiksel analizler

Genotipik frekanslar genotiplerin doğrudan sayılması ile aşağıdaki formüle göre hesaplanacaktır.

ƒ= nij

N nij: ij genotipine sahip hayvanların sayısını, N toplam hayvan sayısını ifade

etmektedir.

Χ2 ve allel frekansları PopGene programı (Yeh ve ark. 2000) kullanılarak hesaplanacaktır.

35

9.4. Beklenen Yararlar /Uygulamaya Aktarma/Ekonomiye Katkı:

Koyun ve keçilerdeki scrapi hastalığı, TSE’ler (transmissive spongiform encephalopathies)

arasında büyük bir öneme sahiptir. Bu hastalık birçok biyomedikal, ekolojik ve ekonomik

araştırmaların odağı olmuştur. CJD (Creutzfeldt-Jacob disease)’nin yeni bir varyant formunun

gelişmesi, BSE ajanının boynuzlugiller, kedigiller ve primatlara bulaşabiliyor olması bu

hastalığın zoonotik potansiyelini ortaya koymaktadır. Bütün bunlar, evcil koyunların, hayvan

TSE’lerinin rezervuarları olduğu sonucunu doğurmaktadır (Novák ve ark. 2000).

Scrapi hastalığı Avrupa (İngiltere dahil), Ortadoğu, Japonya, Kanada, ABD, Güney Afrika,

Kolombiya ve Asyanın bazı bölgelerinde rapor edilmiştir. Birçok ülkedeki hastalık durumu,

herhangi bir izleme programına sahip olmamaları nedeniyle bilinmemektedir. Avustralya ve

Yeni Zellanda scrapiden ari kabul edilmelerine rağmen bu ülkelerde hastalık ortaya çıkmış ve

ithal edilen koyunların itlaf edilmesiyle eradikasyon sağlanmıştır (Anonim 2007b).

Basında yer alan haberlere göre; son olarak Güney Kıbrıs Rum Kesiminde scrapi hastalığının

ortaya çıktığı ve bölgedeki 430 bin baş olan küçük baş hayvan varlığının yaklaşık 1/4 ‘ünün

itlaf edilmesi gerekeceği belirtilmektedir (Anonim 2007c).

Bu bilgilerin ışığında scrapi hastalığının Ülkemiz için taşıdığı riskler tekrar gözden

geçirilmelidir. Yapılmak istenilen bu çalışmada scrapi hastalığına dirençli yetiştiricilik

stratejilerinin oluşturulması konusunda bir adım atmak amaçlanmıştır. Olası bir scrapi salgınının

hem insan ve hayvan sağlığına, hem de Ülke ekonomisine vereceği zararlardan korunmanın, bu

hastalığa dirençli yetiştiricilikle mümkün olabileceği düşünülmektedir.

10. ÖNERİ SAHİPLERİNİN YETERLİLİĞİ:

10.1. Proje Lideri Adı-Soyadı :Yalçın YAMAN

Özgeçmiş

01.03.1976 yılında Konya’da doğdum.1993 yılında Konya Veteriner Sağlık Meslek lisesini

bitirdim. Aynı yıl Tarım ve Köyişleri Bakanlığında Vet.Sağ.Teknisyeni olarak göreve

başladım.1993-1995 yılları arasında Sivas-Hanlı Köy Grup Teknisyenliğinde,1995-1996 yılların

arasında Sivas-Gölova Tarım İlçe Müdürlüğünde,1996-2002 yılları arasında Van-Erciş Tarım

İlçe Müdürlüğünde Vet.Sağ.Teknisyeni olarak görev yaptım.2002 yılı Ocak ayında Yüzüncü Yıl

Üniversitesi Veteriner Fakültesinden mezun oldum.2002-2003 yılları arasında Eskişehir-

Mihalgazi tarım ilçe Müdürlüğünde Vet.Hekim olarak görev yaptım.2003 yılı ekim ayından bu

yana Marmara Hayvancılık Araştırma Enstitüsünde Veteriner Hekim olarak görevimi

sürdürmekteyim.

Yayınları:

1-Karadağ,O., Köycü, E., Sezenler, T., Yaman, Y., Ceyhan, A., (2007), Saanen ve Saanen

Melezi (SaanenxKıl) Keçilerin İlk Yaş Üreme Özellikleri ve Erken Damızlıkta Kullanılma

Olanakları.(Basımda)

10.2. Eş Danışman: Yrd. Doç. Dr. Cemal ÜN

Özgeçmiş

Doğum Yılı: 1968

Yazışma

Adresi :

Yıldız Teknik Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü

Davutpaşa/İstanbul 34210 İstanbul/Türkiye

36

EĞİTİM

Mezuniyet Yılı Derece Üniversite Öğrenim Alanı

1991 Lisans Ege Üniversitesi ZOOTEKNİ

1996 Yüksek Lisans Ege Üniversitesi HAYVAN YETİŞTİRME

2002 Doktora Universität Bonn Hayvan Islahı-Moleküler

genetik

AKADEMİK-MESLEKTE DENEYİM

Görev Dönemi Görev Türü Kuruluş

2003- Yrd. Doç. Dr. Yıldız Teknik Üniversitesi

UZMANLIK ALANLARI

Uzmanlık Alanları

Moleküler Biyoloji ve Genetik

Scrapie hastalığının genetiği, BSE hastalığının genetiği, QTL, Genetik haritalama,

moleküler markır, Hemofili A, dizi analizi

Kurslar

8 – 12 Mart 1999 : Course on Bioinformatics „From QTL to Sequence“

Munich/GERMANY

26.05 – 02 – 05 1999 : Segregation and Linkage Analysis

Hannover/ GERMANY

29.09-02.10.2002 : Medical Genetics

Leipzig/Germany

Burslar

PhD scholarship holder of University of Bonn 1998-2000

DFG scholarship for 3 months march-may 2007

Ün, C, Öztabak K (2007). Mandalar BSE ye Dayanıklı mıdır? Hasad Hayvancılık. Yıl:23

Sayı:271 Sayfa:54-57

Ün, C. (2007). Koyunlarda scrapie hastalığının genetiği ve ıslahı. Hasad Hayvancılık. Yıl:23

Sayı:270 Sayfa:28-30

*Ün, C., Öztabak, K., Özdemir, N., Akış, I., Mengi, A. 2007. Genotyping of PrP gene in native

Turkish Sheep. Small Ruminant Research. Vol 74/1-3 pp 260-264

*Liu G, Jennen DG, Tholen E, Juengst H, Kleinwachter T, Holker M, Tesfaye D, Un G,

Schreinemachers HJ, Murani E, Ponsuksili S, Kim JJ, Schellander K, Wimmers K

(2007): A genome scan reveals QTL for growth, fatness, leanness and meat

quality in a Duroc-Pietrain resource population. Anim Genet 38, 241-252

37

Tesfaye D, Worku D, Salilew D, Hoelker M, Rings F, Un C, Schellander