Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

3. Kutatási cél

Munkánk során arra kerestünk választ, milyen védekező mechanizmusok indukálódnak a kukoricanövényekben a kadmiumkezelést követően. Vizsgálni kívántuk továbbá azt is, hogy van-e különbség a levél és a gyökér kadmiumkezelésre adott válaszreakcióiban. Munkánk legfőbb célja az volt, hogy tanulmányozzuk az endogén jelátvivő molekula, a szalicilsav akkumulációját a kukorica kadmiumstresszre adott válaszreakciója során. Ezért a következő vizsgálatok elvégzését tűztük ki célul:

• 
  Annak érdekében, hogy a kadmium indukálta oxidatív stresszt detektáljuk, három stresszmarker értékeinek (klorofilltartalom, lipidperoxidáció és klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter) változásait követjük nyomon.
  
• 
  Vizsgáljuk, a kadmiumkezelés során hogyan változik a membránpermeabilitás, ezért mérjük a különböző membránfrakciók zsírsavösszetételének, kettőskötés indexének, valamint a telítetlenségi százalék értékének változásait.
  
• 
  Az antioxidáns védekezőrendszert vizsgálva meghatározzuk a kataláz, az aszkorbát-peroxidáz, a glutation-S-transzferáz, a glutation-reduktáz és a gvajakol-peroxidáz enzimek aktivitásában bekövetkező változásokat.
  
• 
  Mérjük a kéntartalmú vegyületek mennyiségi változásait. Vizsgáljuk a glutation és annak prekurzorainak (cisztein és -glutamilcisztein), valamint a nehézfémstressz hasznos és korai figyelmeztető jelének a fitokelatinok szintézisének indukcióját, továbbá a fitokelatin szintáz szövetspecifitását. Összefüggést keresünk az in vivo fitokelatin szint és az in vitro fitokelatin szintáz aktivitásának változásai között.
  
• 
  Megvizsgáljuk a szalicilsav (szabad és konjugált formájának) akkumulációját kadmiumkezelést követően. Továbbá lehetséges prekurzorainak mennyiségi analízise során arra keressük a választ, hogy kukoricában kadmiumstressz során a szalicilsav milyen útvonalon szintetizálódhat.
  

4. Anyagok és módszerek

4.1. Növényi anyag, növénynevelés, kadmiumkezelés paraméterei

A kukorica (Zea mays L., Norma hibrid) szemeket 30 percig 0,5%-os Neomagnol oldatban fertőtlenítettük, majd desztillált vízzel nedvesített szűrőpapírban csíráztattuk 3 napig 26°C-on. A növényeket főzőpohárban (7/pohár), a martonvásári Mezőgazdasági Kutatóintézet fitotronjában neveltük 250 ml módosított Hoagland-tápoldaton, melynek összetétele az 1. táblázatban látható.

1. táblázat A növényneveléshez használt tápodat összetétele.

Makroelem összetétel:	Mikroelem összetétel:
0,3125 mM KNO3	11,92 M HBO3
0,45 mM Ca(NO3)2	4,57 M MnCl2·4H2O
0,0625 mM KH2PO4	0,191 M ZnSO4·7H2O
0,125 mM MgSO4·7H2O	0,08 M CuSO4·5H2O
	0,024 M (NH4)6Mo7O24·4H2O
	15,02 M FeSO4·7H2O
	23,04 M Na2EDTA·5H2O

A kukoricanövényeket 22/20C-on 16/8 órás fény-sötét periódus mellett neveltük Conviron PGR-15 típusú növénynevelő kamrában (Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Canada) 10 napos korig. A megvilágítás mértéke 340 mol m^-2 s^-1 PPFD, a relatív páratartalom 75% volt. A tápoldatot kétnaponta cseréltük.

A kadmiumkezelés hatásának vizsgálatához a 10 napos növénykék tápoldatát 0, 10, 25 és 50 M koncentrációkban Cd(NO₃)₂-ot tartalmazóra cseréltük. A kezelés 7 napig tartott, mialatt a kontroll és kadmiummal kezelt növények tápoldatát kétnaponta cseréltük.

4.2. Klorofilltartalom mérése

A teljes klorofilltartalom meghatározásához SPAD-502 klorofillmérő (Minolta Camera Co., Ltd, Tokyo, Japan) berendezést használtunk. A mérés alapját a levélen áthaladt infravörös és vörös fény erősségének aránya képezi. Ez az arány annál nagyobb, minél több vörös fény nyelődik el a levélben, ami szoros összefüggést mutat a klorofilltartalommal. A SPAD-érték 0-tól 100 feletti értékig terjedhet.

A méréseket a harmadik levélen a kadmiumkezelés kezdetétől számított 1, 4 és 7 nap elteltével végeztük.

4.3. Lipidperoxidáció meghatározása

A lipidperoxidáció meghatározása az MDA tartalom mérésén alapszik. Az előkészítés során 0,2 g növényi mintát dörzsmozsárban 600 l 0,1%-os (w/v) triklór-ecetsavval (TCA) eldörzsöltünk, majd 12000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó 300 l-éhez 2 ml 0,5% (w/v) tiobarbitursavat (TBA) tartalmazó 20%-os (w/v) TCA-t adtunk és az elegyet 90C-on 30 percig inkubáltuk. Az MDA tartalom meghatározása spektrofotometriásan, 532 nm-en történt, a 600 nm-en mért nem specifikus abszorpció figyelembevételével.

A lipidperoxidok koncentrációját az MDA tartalomból a 155 mM^-1 cm^-1 extinkciós koefficiens segítségével számoltuk ki, és pmol g^-1 friss tömeg adtuk meg (Thomas és mtsai, 2004). A kukoricanövények harmadik levél, illetve gyökér MDA tartalmának mérését a kadmiumstressz első, negyedik és hetedik napján végeztük.