Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

4.4. Klorofill fluoreszcencia indukció mérése

A F/F_m’ klorofill fluoreszcencia indukciós paramétert (F/F_m’ = (F_m’ – F_s)/ F_m’, ahol az F_m’ a maximális, míg az F_s a steady state klorofill fluoreszcencia szinteket jelölik fény adaptált állapotban) Janda és mtsai (1994) által leírtak szerint PAM-2000 típusú (Walz, Effeltrich, Németország) fluorométerrel 22C-on, a növénynevelő kamrában mértük. A mérések 7 napos kadmiumkezelést követően a harmadik teljesen kifejlett levélen történtek.

4.5. Lipid extrakció és zsírsav analízis

A lipid extrakció Bligh és Dyer (1959) módszere szerint történt. 1 g növényi mintát folyékony nitrogénben eldörzsöltünk, majd 3x4 ml metanol: kloroform = 2:1 elegyével centrifugacsővekbe átmostuk, 4 ml vizet adtunk hozzá, és alaposan összeráztuk, illetve vortexeltük. A dörzsmozsarat még egyszer 4 ml kloroformmal átmostuk a centrifugacsőbe és 4 ml 2 %-os NaCl oldatot mértünk hozzá. Az extraktumot összeráztuk, vortexeltük és 10 percig 5000 g-vel centrifugáltuk. Az alsó kloroformos fázist Pasteur pipettával üvegfiolába pipettáztuk, és a csapadékot 2,5 ml kloroformmal újra extraháltuk, összeráztuk, vortexeltük és 5 percig 5000 g-vel centrifugáltuk. Az alsó kloroformos fázist Pasteur pipettával leszívtuk, és az előzőhöz adtuk. A mintákat vákuumbepárlóban szárazra pároltuk, majd 500 l toluol: etanol = 4:1 elegyével visszaoldottuk, és a mérésig −20°C-on tároltuk.

Az összlipid extraktumból a lipid frakciók szétválasztása vékonyréteg kromatográfiával történt. Az extraktumból 4 x 50 l-t vittünk fel Hamilton fecskendővel a 20 x 20 cm-es szilikagél (szilikagél 60, Merck, Darmstadt, Germany) rétegre. Száradás után a futtatás a következő összetételű futtató elegyben történt: 50 ml kloroform, 20 ml aceton, 10 ml metanol, 10 ml ecetsav és 5 ml víz. Futtatás utána a réteget megszárítottuk, majd primulinnal (100 mg primulin/100 ml aceton:víz = 4:1) lefújtuk. Száradás után UV-fényben a szétvált frakciók foltjai ceruzával körülrajzolhatók. Az egyes foltokat lekapargattuk, és üvegfiolába raktuk.

A zsírsavak metilészterezése Pham-Quoc és mtsai (1994) által leírtak szerint történt. A lekapargatott szilikagélhez 3 ml kénsavas metanolt (97,5 ml metanol és 2,5 ml kénsav) és belső standardként, 10 l heptadekánsavat (1 g/ l) adtunk. Az elegyet 45 percre 70°C-os vízfürdőbe, ezután 10 percig jégre helyeztük. A mintákhoz 1 ml vizet és 0,5 ml heptánt adtunk és vortexeltük. A fázisszétválás után a felső heptán fázist Pasteur pipettával gázkormatográfiás (GC) fiolákba pipettáztuk és a GC analízisig −20°C-on tároltuk.

A gázkromatográfiás mérés paraméterei a következők voltak:

Gázkromatográf típusa: Shimadzu GCMS-QP2010 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan)

Oszlop típusa: SP-2380 kapilláris oszlop (30 m x 0,25 mm I.D., df= 0,20 m) (Supelco/Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA)

Injektor hőmérséklete: 200°C

Injektálás: split módban 1/5 split aránnyal

Vivőgáz: He, sebessége: 37,8 cm/perc

A mérés során a kollonnatér hőmérséklete a következőképpen változott: a kezdeti 175°C-os hőmérséklet, nyolc perc elteltével 50°C/perc sebességgel 240°C-ra emelkedett, és ezt 5 percen át tartotta.

Detektor: tömegspektrométer (MS)

Ionforrás és interface hőmérséklete: 200 °C

Solvent cut time: 2 perc

Az adatok kiértékelése a GCMS 2.10 szoftverrel történt (Shimadzu C., Kyoto, Japan).

A telített, egyszeresen telítetlen, kétszeresen és háromszorosan telítetlen zsírsav metilészterek azonosításához a 74, 55, 67 és 79 tömeg/töltés (m/z) értékű ionokat követtük nyomon.

A kettőskötés indexet, a DBI = a telítetlen zsírsavak mol% x az egyes telítetlen zsírsavakban lévő kettőskötések számával [1x(18:1%) + 2x(18:2%) + 3x(18:3%)] képlet, illetve a telítetlenségi százalék értékeket, a telítetlenségi% = 18:1% + 18:2% + 18:3% képlet segítségével a mól% értékekből számítottuk.

4.6. Cisztein-, γ-glutamilcisztein- és glutationtartalom meghatározása

A tiol vegyületek meghatározása Kocsy és mtsai (2004) módszere alapján történt. A minta előkészítés során 0,4 g növényi mintát folyékony nitrogénben 2 ml 0,1 M HCl és 1 mM Na₂EDTA jelenlétében eldörzsöltünk. A mintákat hűtött centrifugában 15000 g-vel 20 percig centrifugáltuk.

A totál tioltartalom meghatározásához a felülúszó 120 l-éhez 180 l 0,2 M 2-(ciklohexilamino)etánszulfonsavat (pH 9,3) és 30 l 3 mM ditiotreitolt mértünk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 60 percig inkubáltuk, mialatt a diszulfid hidak redukálódtak. A származékképzéshez 20 l 15 mM monobromobimánt adtunk a reakcióelegyhez és sötétben, szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk. A tiol csoportok származékképzése ez idő alatt történt meg, majd a reakciót 350 l 0,25%-os (v/v) metánszulfonsavval leállítottuk.

A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumparendszer, mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert és egy W474 scanning fluoreszcens detektor. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt.

A totál tiol tartalmú mintákból 20 l-t injektáltunk a 10 m szemcseméretű, 250 x 4 mm méretű BST Rutin 10 C18 BD oszlopra. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk:

A: 90% víz, 10% metanol (MeOH), 0,25% ecetsav (pH 3,9)

B: 90% MeOH, 10% víz, 0,25% ecetsav.

Az elválasztás a 2. táblázatban található gradiens programmal történt. Az áramlási sebesség az analízis során 1,5 ml/perc, az oszlophőmérséklet 30C volt.

2. táblázat A cisztein, γ-glutamilcisztein és glutation HPLC analízise során használt gradiens program.

	Idő (perc)	A%	B%
1	0	100	0
2	10	92	8
3	15	86	14
4	17,5	0	100
5	25,5	0	100
6	26,5	100	0
7	31	100	0

A származékképzett minták detektálása fluoreszcens detektorral 380 nm-es gerjesztési és 480 nm-es kisugárzási hullámhosszon történt.