Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

2.2. A kadmium élettani hatásai növényekben

2.2.1. A kadmium hatása a növekedésre

A nehézfémstressz legáltalánosabb, látható, de kevéssé specifikus tünete a növekedésgátlás, mely kukoricanövényekben is jól tanulmányozott. A kadmium visszaveti a csírázási folyamatokat és a csíranövények fejlődését, habár a kadmium nem képes áthatolni a maghéjon (Rascio és mtsai, 1993; Seregin és Kozhevnikova, 2005). A kikelt növények gyökér- és hajtáshossza, friss- és száraztömege, illetve hozama csökken (Dániel és Győri, 2000). 24 órás, 1 M-os Cd kezelés már 30%-os gyökérnövekedés gátlást eredményezett, a növekedésgátlás koncentrációfüggő volt és pozitív korrelációt mutatott a gyökérsejtek életképességének csökkenésével (Siroka és mtsai, 2004). Más irodalmi adatok szerint 3 órás, 50 és 250 M Cd kezelés gyökérnövekedést stimuláló hatású volt, míg ezt követően a növekedésgátlás a kezelés előrehaladtával egyre kifejezettebbé vált (Wójcik és Tukendorf, 1999). A kadmium növekedést serkentő hatása nem egyedülálló eset, néhány nehézfém növekedést stimuláló hatása az irodalomból ismert (Ernst és mtsai, 1992). Öt napos, 100 M-os kadmiumkezelés stimulálta a kukoricaszemek csírázását, ami a kadmiumtoxicitást kompenzáló magasabb vízfelvétellel magyarázható, és a kadmium csírázásgátló hatását csak 1 mM-os koncentráció felett tapasztalták (Klejdus és mtsai, 2004).

Kimutatták továbbá, hogy a Cd gátolja az oldalgyökérképzést, a gyökerek megbarnulnak, rigiddé és csavarodottá válnak, a koleoptil extenziója csökken, valamint a kezelés klorózist és nekrózist eredményez (Gunse és mtsai, 1992; Wójcik és Tukendorf, 1999; Nocito és mtsai, 2002; Wang és mtsai, 2007).

A gyökérnövekedés gátlás hátterében részben a gátolt mitózis, a sejtfal komponensek csökkent szintézise, a Golgi-apparátus károsodása, a poliszacharid metabolizmus változásai állnak, míg a barnulását a szuberin berakódás eredményezi (Punz és Sieghardt, 1993). A kadmiumos kezelés hatására több növényfajban megfigyelték, hogy a sejtosztódás nem áll le ugyan, de a képződött sejtek növekedése gátolt. A sejtnövekedés kadmiumkezelés hatására oly módon gátolt, hogy a sejtfal pektin molekulái között erősebb keresztkötések alakulnak ki, s feltehetően ez gátolja a sejtek növekedését, továbbá a sejtek közötti állomány mérete is csökken (Prasad, 1995a).

Az ólom, és valószínűleg a kadmium, egyik specifikus hatása a kukoricagyökér sejtjeiben tapasztalt mikrotubulus károsodás, amely a sejtosztódás gátlásához vezet (Eun és mtsai, 2000). A különböző stresszek, köztük a kadmium is, lignin beépülést indukál a kukoricagyökér sejtfalába, ennek hatására a sejtfal rigiditása nő, expanziója csökken (Degenhardt és Gimmler, 2000). Kukoricában a kadmium hatására sejtosztódáskor kétmagvú sejtek képződését, és metafázisban kromoszóma-aberrációt figyeltek meg (Melnyicsnyuk és Lisko, 1991).

A kadmium hajtásnövekedésre kifejtett gátló hatása kukoricában a levélszegmens korától is függ, és legnagyobb mértékben az érett levélszegmensekben tapasztalható (Drazkiewicz és Baszynski, 2005).

Mivel a kadmium nagyobb mértékben gátolja a gyökérnövekedést, mint a hajtásnövekedést, ami a kadmium gyökérben kifejtett fehérjeszintézist gátló hatásából adódhat (Drazkiewicz és Baszynski, 2005), ezért kadmium gyökérelongációit gátló hatásának nyomon követése a legáltalánosabban használt módszer a kadmium toxicitás meghatározására.

2.2.2. A kadmium hatása a membránokra

A plazmamembrán az első sejtstruktúra, mellyel a nehézfémek kapcsolatba kerülnek. Nehézfémstressz hatására megváltozik a lipidösszetétel, ezáltal megváltozik a membránhoz kötött enzimek aktivitása (Ros és mtsai, 1990; Fodor és mtsai, 1995). Számos tanulmány szól arról, hogy a nehézfémek lipidperoxidációt okoznak (Hernández és Cooke 1997; Verdoni és mtsai, 2001; Rucinska és Gwózdz, 2005; Nouairi és mtsai, 2006; Rellán-Álvarez és mtsai, 2006), csökkentik a lipidtartalmat (Ouariti és mtsai, 1997; Chaffai és mtsai, 2005; Nouairi és mtsai, 2006). Krantev és mtsai (2006) kadmiumkezelés hatására megnövekedett elektrolit kiáramlást és malondialdehid (MDA) tartalmat mértek, mely jelzi, hogy a kadmium lipidperoxidációt indukált a kukoricanövényekben.

A különböző lipidfrakciókban és a zsírsavösszetételben indukált változások eltérőek lehetnek, és függnek a vizsgált növényfajtól, -szövettől, valamint az alkalmazott nehézfémiontól (Stefanov és mtsai, 1993, 1995; Hernández és Cooke 1997; Ouariti és mtsai, 1997; Verdoni és mtsai, 2001; Pukacki és Kaminska-Rozek, 2002; Chaffai és mtsai, 2005; Djebali és mtsai, 2005; Nouairi és mtsai, 2006; Chaffai és mtsai, 2007a,b). Összegezve azonban megállapítható, hogy a nehézfémstressz hatására a membránpermeabilitás, fluiditás megváltozik. A magasabb telítetlen zsírsav arány és a poláris lipidek mennyiségének növekedése előnyösebb az optimális membrán funkciók fenntartásában, lehetővé téve a növény növekedését a nehézfémstressz során. Ugyanakkor az alacsonyabb telítetlen zsírsav aránynak és DBI értékeknek szerepe lehet abban, hogy neheziti a nehézfémek felvételét.

A kadmium a plazmamembrán ATP-áz aktív centrumának SH-csoportjaihoz kötődve gátolja annak működését kukoricában (Kennedy és Gonsalves, 1987). A legújabb eredmények azonban azt mutatják, hogy a kadmium nem befolyásolja az ATP-áz aktivitást kukoricagyökérből izolált membrán vezikulákban, ennek ellenére a proton transzport jelentősen csökkent. Ennek magyarázata, hogy a kadmiumkezelés hatására megváltozik a membránpermeabilitás és a passzív H⁺-ion transzport befolyásolta a méréseket (Astolfi és mtsai, 2005).

2.2.3. A kadmium hatása a tápelem felvételre és a vízháztartásra

A nehézfémek esszenciális makro- és mikroelemekkel léphetnek kölcsönhatásba, ezáltal jelentősen befolyásolják a növények tápelem felvételét. Ennek a kölcsönhatásnak a természete függ például az ion koncentrációktól, a pH-tól, kelátok jelenlététől, így az ilyen irányú kísérletekből származó eredmények heterogének, nehezen összehasonlíthatók. A kadmium kukoricában kifejtett hatásáról is eltérő irodalmi adatok vannak. Korábbi adatok szerint a kadmium csökkenti a vas felvételét (Haghiri, 1973), míg Wang és mtsai (2007) azt találták, hogy a kadmiummal kezelt kukoricanövényekben nagyobb mennyiségű vas akkumuládott a kontrollhoz képest. Igazolták, hogy a Cd csökkenti a N, P, K, Zn, Cu és Na felvételét (Narwal és Mahendra-Singh-Singh, 1993), míg mások csökkent K felvételt, de változatlan foszfát felvételt tapasztaltak (Nocito és mtsai, 2002), de leírták a K tartalom növekedését is (Ciecko és mtsai, 2004). Más szerzők a mangántartalom csökkenése és a réztartalom növekedése mellett nem találtak változást a Ca, Mg és Zn mennyiségében (Obata és Umebayashi, 1997). Wang és mtsai (2007) szintén a Mn és Zn tartalom csökkenéséről, míg a Cu tartalom megemelkedéséről számoltak be kukoricában. Yang és mtsai, (1996) a Cu, Zn, Fe, Mn, Ca, Mg gyökér influx és gyökér-hajtás transzport csökkenését, míg a P influx és transzport növekedését írták le.

A nehézfémek befolyásolják a vízháztartást, a hajszálgyökérképzés gátlásával direkt módon csökkentik a felszívó felületet. Csökkentik a membránpermeábilitást, a vízszállító edények számát és átmérőjét (Barceló és Poschenrieder, 1990). Kadmiumkezelés során a friss tömeg és a víztartalom kukoricanövényekben is csökken (Prasad, 1995b; LozanoRodriguez és mtsai, 1997; Wójcik és Tukendorf 1999; Drazkiewicz és mtsai, 2003; Ekmekci és mtsai, 2008). A víztartalom kadmiumkezelés során az érett levélrészekben nagyobb mértékben csökkent, mint a fiatalabb illetve öregebb szegmensekben (Drazkiewicz és Baszynski, 2005).

Bazzaz és mtsai, (1974) kukoricában a kadmium koncentráció-, és időfüggő nettó fotoszintézis és transpiráció gátlása között egyenes összefüggést tapasztalt, ami azt jelzi, hogy a kadmium egyik korai hatása a sztómazárás indukciója.

Három lehetséges mechanizmus okozhatja a magas sztómaellenállást: 1) Alacsony kadmiumkoncentráció, rövid idejű kitettség esetén, habár a gyökér növekedését már gátolja, a levélben toxikus hatást nem okoz, sőt a fotoszintézist serkenti, és a megemelkedett szacharóz-koncentráció csökkenti az ozmotikus potenciált, növeli a turgort, sztómazáródást okoz. 2) Mérsékelten magas kadmiumkoncentráció és hosszú idejű kitettség esetén a vízfelvétel és a transzport mechanizmusok károsodnak a gyökércsúcssejtek degenerációjából következően. A relatív víztartalom, és a citokinin transzport csökken a gyökérből, növelve az abszcizinsav tartalmat, hidroaktív sztómazáródást eredményezve. 3) Magas koncentráció és hosszabb idejű kitettség turgorvesztést és hidropasszív sztómazáródást eredményez (Prasad, 1995a).

2.2.4. A kadmium hatása az anyagcsere folyamatokra

A kadmium miután bejut a növényi sejtbe, a citoszólban és a sejtorganellumokban a növényi anyagcsere folyamatokat befolyásolja. Kölcsönhatásba léphet fehérjékkel, így csökkentve az enzimek aktivitását. Különböző növényekben bizonyított, hogy a kadmium számos enzim aktivitását befolyásolja (Sanita di Toppi és Gabbrielli, 1999). Gátló hatását kifejtheti azáltal, hogy a fehérjék szulfhidril csoportjaihoz kötődik, vagy a metalloproteinek esszenciális fémionjait (Zn²⁺, Ca²⁺) helyettesíti, ugyanakkor konformáció változást indukálva is csökkentheti az enzimek aktivitását (Van Assche és Clijsters, 1990; Clemens, 2006). A NADPH oxidációjával csökkenti a redukáló reakciók proton forrását, így gátló hatással van a hidrogén donorként NADPH-t használó, különböző metabolikus folyamatokra is (Nussbaum és mtsai, 1988; Ferretti és mtsai, 1993).

A kadmium gátolja a produkció szempontjából az egyik legfontosabb metabolikus folyamatot, a fotoszintézist. A kadmium károsítja a kukorica kloroplasztiszokat (Rascio és mtsai, 1993; Ghoshroy és Nadakavukaren, 1990), a kadmium indukálta membrán dezorganizáció döntően a gránumtilakoidokat érinti (Souza és mtsai, 2005).

Kukoricában a kadmium gátolja a klorofill bioszintézisét (Parekh és mtsai, 1990), és csökkenti a teljes klorofill és karotinoid tartalmat, bár ez utóbbit kevésbé, ezáltal csökken a klorofill/karotinoid arány (Ferretti és mtsai, 1993). A kukorica fiatal levélszegmenseiben 100 és 200 M Cd növelte, érett levél részekben 100 M Cd növelte, de 200 M csökkentette, míg öregedő levél részekben mindkét koncentráció csökkentette a klorofill a és b tartalmat (Drazkiewicz és mtsai, 2003). Alacsony kadmiumkoncentrációk (0,05 és 0,1 M) klorofillszintézist és fotoszintetikus aktivitást stimuláló hatását is leírták (Nyitrai és mtsai, 2003), más adatok szerint viszont már 1,7 M kadmium csökkentette a klorofilltartalmat kukoricában (Lagriffoul és mtsai, 1998). A klorofill a/b arány csökkenése, a második fotokémiai rendszer (PSII) / első fotokémiai rendszer (PSI) arány eltolódását, illetve az antenna klorofill összetétel módosulást jelzi (Drazkiewicz és Baszynski, 2005).

Izolált kukorica kloroplasztiszokkal végzett kísérletekben azt tapasztalták, a kadmium a PSII oxidáló oldalán, a vízbontó komplex szintjén fejti ki gátló hatását. A PSII körüli elektrontranszportot a tilakoid membrán és polipeptid-összetétel megváltoztatásával, és zsírsavak felszabadításával gátolhatja (Bazzaz és Govindjee, 1974). Az első fotokémiai rendszert sokáig rezisztensnek vélték, de közvetett módon itt is kifejtheti gátló hatását. Mivel a kadmiumkoncentráció emelkedésével a vastartalom csökken, feltételezve, hogy a vashiány csökkenti a ferredoxin koncentrációt, nem meglepő, hogy a kadmiumkezelt kukoricanövényekben csökken a ferredoxin-függő NADP⁺ fotoredukció (Siedlecka és Baszynski, 1993).

A tartós sztómazáródás, a kloroplasztiszok károsodása, és a vízegyensúly felborulása együttesen eredményezi a kadmiummal kezelt növények korai öregedését, ezáltal a fotoszintetizáló felület, és a produktivitás csökkenését (Rascio és mtsai, 1993).

A fotoszintézisen kívül a kadmium a nitrogén és kén anyagcserét is befolyásolja. A kén és a nitrogén, mint makroelem elengedhetetlen a fehérje szintézishez és így fontos szerepet játszik a növényi növekedésben és fejlődésben. Kadmiumkezelés hatására a kukoricagyökér szulfátfelvétele megkétszereződik azáltal, hogy a nagy affinitású szulfát transzporter V_max értékét, valamint mRNS-ének szintjét növeli (Nocito és mtsai, 2002). A kadmium a szulfát-asszimiláció első két enzimének, az ATP-szulfuriláznak és az adenozin 5’-foszfoszulfát reduktáznak, valamint az utolsó enzimének, az O-acetilszerin-tiol-liáznak aktivitását megnövelte kukoricában (Nussbaum és mtsai, 1988; Ferretti és mtsai, 1993). Szintén kukoricában a nitrát- és ammónia-asszimiláció kulcs enzimeinek, a nitrát reduktáznak és a glutamin szintetáznak aktivitását serkentette a kadmiumkezelés (Ferretti és mtsai, 1993). Ellenben Boussama és mtsai, (1999) azt találták, hogy a kadmiumkezelés a nitrogén anyagcserében direkt és indirekt módon szerepet játszó enzimek, úgymint nitrát reduktáz, nitrit reduktáz, glutamin szintetáz, ferredoxin-glutamát szintáz, NADH-glutamát szintáz aktivitását gátolja, míg a glutamát dehidrogenáz aktivitást serkentette kukoricában. Ju és mtsai (1997) kadmium hatására nagyobb foszfoenolpiruvát-karboxiláz (PEPC) és glutamin szintetáz polipeptid mennyiséget mért, viszont a glutamát dehidrogenáz és a glutamát szintáz szint nem változott.

A kén-metabolizmus enzimei a cisztein, míg a nitrogén-metabolizmus enzimei a glutaminsav szintézisében nélkülözhetelenek. A glutation (GSH) bioszintézise során az első lépesben ciszteinből és glutaminsavból a glutamilcisztein szintetáz enzim katalizált reakcióban glutamil-cisztein (-EC) szintetizálódik, majd GSH szintetáz egy -EC és glicin ligálásával hozza létre a GSH-t. Kadmiumstressz során a GSH szintézis két limitáló reakcióját katalizáló enzim a -glutamil-cisztein szintetáz és GSH szintetáz aktiválódását is leírták (Rüegsegger és Brunold, 1992; Szalai és mtsai, 2002) kukoricában.

A kadmiumkezelés stimulálja a légzést kukoricából izolált mitokondriumban (Bittell és mtsai, 1974), továbbá a kukoricagyökérben befolyásolja a glikolízis enzimeinek aktivitását és az alternatív légzési kapacitást (Nocito és mtsai, 2008).

2.2.5. A kadmium indukálta oxidatív stressz

A növényeknek, mint minden aerob élőlénynek, oxigénre van szükségük az energiatermeléshez. A molekuláris oxigénből számos módon képződhetnek részlegesen redukált reaktív oxigénformák (ROS), melyek reakciókészsége igen nagy, ezért féléletidejük rövid. A reaktív oxigénformák különböző mértékben minden növényben jelen vannak az aerob anyagcsere eredményeként. Számos abiotikus stressz, így a nehézfémstressz során is megnő a reaktív oxigénszármazékok koncentrációja a sejtekben (Dat és mtsai, 2000).

A divalens kadmium kation (Cd²⁺) más fémekkel (Cu, Fe) ellentében nem képes részt venni a Fenton-reakcióban, ennek ellenére reaktív oxigénformák megjelenését, oxidatív stresszt és lipidperoxidációt indukál (Shah és mtsai, 2001).

A fotoszintézis hatékonyságát a Calvin-ciklus kulcsenzimeinek gátlásával csökkentik a nehézfémionok (Stiborova és mtsai, 1986). Kukoricában 10 M Cd gátolja a foszfoenolpiruvát-karboxiláz aktivitását (Vojtechová és Leblová, 1991), míg Krantev és mtsai (2006) azt tapasztalták, hogy 14 nap elteltével már 10 M Cd csökkenti a ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz (RUBISCO) aktivitását, de csak 25 M Cd képes gátolni a PEPC aktivitását. A glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz, izocitrát-dehidrogenáz, malát enzim aktivitását is csökkenti a kadmiumkezelés kukoricában (Lagriffoul és mtsai, 1998). Mivel a kadmium a Calvin-ciklus enzimeit gátolja, csökken a NADPH felhasználás és a PSI redukáló oldalán az oxigén molekulák 1 elektronos redukciója következik be, így hatását indirekt módon fejti ki.

A ROS képződés három fő módját különíthetjük el a növényi sejtekben: 1) a fotoszintetikus, illetve a légzési elektron transzportlánc túlterheltsége során bekövetkező elektron kiáramlás következtében, 2) a gerjesztett, triplett állapotú klorofillmolekulák és oxigénmolekulák reakciója során, 3) valamint különböző oxidázok és peroxidázok reakciótermékeként, mint pl.: a peroxiszómákban, a fotorespirációban szerepet játszó glikolát-oxidáz, vagy a membránkötött NADPH-oxidáz, és sejtfalhoz kötött peroxidázok katalizálta reakciókban képződhetnek redukált reaktív oxigénformák (Mittler, 2002; Edreva, 2005).

Egy elektron felvételével a molekuláris oxigénből szuperoxid-aniongyök (O₂˙¯) keletkezik. Ez közepesen reakcióképes, rövid féléletidejű (2−4 μs) ROS, mely nem jut át a sejtmembránon. A szuperoxid-gyök további elektronfelvétellel hidrogén-peroxiddá (H₂O₂) alakulhat, illetve kinonokat vagy átmeneti fémkomplexeket redukálhat, így befolyásolva egyes fémtartalmú enzimek aktivitását. Vizes oldatban egy proton felvételével hidroperoxil-gyökké (HO₂˙) alakul, mely már át tud jutni a sejtmembránon, és hidrogén atomok elvonásával lipid autooxidációt indíthat el (Edreva, 2005).

Gerjesztési energia hatására a molekuláris oxigénből szinglet oxigén (¹O₂) keletkezik. Ez vizes közegben körülbelül 4 μs ideig van jelen, majd átadja gerjesztési energiáját, illetve reakcióba lép egyes vegyületekkel és endoperoxidokat, vagy hidroperoxidokat hoz létre (Knox és Dodge, 1985).

A hidrogén-peroxid közepes reakcióképességű, viszonylag hosszú (1 ms) féléletidejű molekula, amely bizonyos távolságra membránokon keresztül is képes diffundálni. Tiol-csoportjuk oxidációja által enzimeket is inaktiválhat (Dat és mtsai, 2000).

A legreaktívabb oxigénforma a hidroxil-gyök, mely hidrogén-peroxidból keletkezik a Haber-Weiss ciklus elemeként ismert Fenton-reakció során fém katalizátor jelenlétében. A fémionok általában oxidált formában fordulnak elő a sejtekben. Szuperoxid-gyök jelenlétében azonban redukálódnak és így képessé válnak arra, hogy a H₂O₂ átalakulását katalizálják hidroxil-gyökké. A hidroxil-gyök bármely biológiai molekulával képes reakcióba lépni, túlzott termelődése sejthalálhoz vezet. A sejtek nem rendelkeznek olyan enzimmel, mely képes lenne eliminálni a hidroxil-gyököt, ezért fontos, hogy szigorú szabályozás alatt álljon a H₂O₂ és a O₂˙¯ mennyisége a sejtekben (Grant és Loake, 2000).