Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

4.7. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitás mérése

Az izolálás során 0,5 g növényi anyagot kvarchomokkal dörzsöltünk el 2,5 ml jéghideg 0,5 mM TRIS pufferben (pH 7,4), 3 mM MgCl₂ és 1 mM EDTA jelenlétében dörzsmozsárban. A homogenátumot hűtött centrifugában 20 percig centrifugáltuk 15000 g-vel. A felülúszót Eppendorf csövekbe osztottuk szét.

A minták összfehérje koncentrációját Bradford (1976) módszerén alapuló Bio-Rad reagenssel határoztuk meg, spektrofotométerben 595 nm-en mérve a reakcióelegy abszorbanciáját. A kalibrációs egyenes elkészítéséhez standardként bovine serum albumint (BSA) használtunk.

A glutation-reduktáz aktivitását a friss, míg a további enzimeket a −20°C-on tárolt fagyasztott felülúszóból mértük. Az enzimaktivitásokat fotometriásan határoztuk meg (Shimadzu UV-VIS 160A). Mérésig a mintákat jégen tartottuk, a méréseket pedig szobahőmérsékleten végeztük. Az enzim aktivitásokat 1 g enzim fehérje által 1 perc alatt okozott abszorbancia változásban (A min^-1 g^-1 fehérje) adtuk meg.

4.7.1. Kataláz (EC 1.11.1.6)

A kataláz aktivitását 240 nm-en mértük, a hidrogénperoxid fogyását nyomon követve. A reakcióelegy össztérfogata 3 ml volt, és 0,44 mM TRIS puffert (pH 7,4) 0,0375% H₂O₂-t és 50 l növényi mintát tartalmazott (Janda és mtsai, 1999). A reakciót a H₂O₂ hozzáadásával indítottuk el.

4.7.2. Gvajakol-peroxidáz (EC 1. 11.1.7)

A gvajakol oxidációja nyomán bekövetkező abszorbancia növekedést 470 nm-en spektrofotométerrel nyomon követve mértük (Ádám és mtsai, 1995), hidrogén-peroxid oldattal indítva a reakciót. A 3 ml reakcióelegy összetétele a következő volt: 88 mM Na-acetát puffer (pH 5,5), 0,88 mM gvajakol, 0,0375% H₂O₂ és 50 l növényi minta.

4.7.3. Aszkorbát-peroxidáz (EC 1.11.1.11)

Az aszkorbát-peroxidáz aktivitását a következő összetételű reakcióelegyben mértük: 0,2 M TRIS puffer (pH 7,8), 5,625 mM aszkorbinsav és 0,042% H₂O₂. A reakcióelegy 2,25 ml volt, mely 50 l mintát tartalmazott, és a reakciót H₂O₂ hozzáadásával indítottuk. Az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en követtük nyomon (Janda és mtsai, 1999).

4.7.4. Glutation-reduktáz (EC 1.6.4.2)

A glutation-reduktáz aktivitásának meghatározásakor a 5,5´-ditio-bis-(2-nitro-benzoesav) (DTNB) redukcióját mértük 412 nm-en a Smith és mtsai (1988) által leírtak szerint. A reakcióelegy 1 ml össztérfogata 75 mM Na-foszfát puffert (pH 7,5), 0,15 mM dietiléntriamin-pentaecetsavat, 0,75 mM DTNB, 0,1 mM NADPH, 1 mM GSSG. A reakciót 50 l minta hozzáadásával indítottuk.

4.7.5. Glutation-S-transzferáz (EC 2.5.1.18)

A glutation-S-transzferáz aktivitásának meghatározása 340 nm-en spektrofotometriásan Mannervik és Guthenberg (1981) módszere szerint történt S-2,4-dinitrofenil-glutation képződését nyomon követve. A 2,75 ml reakcióelegy 72,5 mM Na-foszfát puffert (pH 6,5), 2,6 mM GSH-t, 1 mM 1-kloro-2,4-dinitrobenzént tartalmazott és a reakciót a 100 l mintával indítottuk.

4.8. Fitokelatin szintáz izolálás és aktivitásmérés

A 750 mg növényi mintát kvarchomokkal dörzsmozsárban 750 l 50 mM TRIS (pH 8,0) pufferrel, mely 10 mM -merkaptoetanolt és 14% (v/v) glicerolt tartalmazott, eldörzsöltük. Eppendorf centrifugában 13000 g-vel 10 percig centrifugáltuk a homogenizátumot, az aktivitásméréshez a felülúszót használtuk. A fitokelatin szintáz aktivitását Chen és mtsai (1997) által leírt módszerrel végeztük. A 300 l végtérfogatú reakcióelegy összetétele a következő volt: 200 mM TRIS (pH 8,0), 10 mM -merkaptoetanol, 10 mM GSH, 0,5 mM Cd(NO₃)₂ és 200 l növényi minta. A reakciót a növényi minta hozzáadásával indítottuk és 60 percig 35°C-on inkubáltuk. A reakció leállításához 30l 50%-os 5-szulfoszalicilsavat használtunk, majd 10 percig jégen inkubáltuk. A kicsapodott fehérjéket 13000 g-vel történt 5 perc centrifugálással távolítottuk el, és a felülúszót használtuk a HPLC analízishez.

A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumparendszer, (mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert), egy darab W 501 pumpa (a származékképzéshez) és egy diódasoros UV/VIS detektor (W996). A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt.

A mintából 100 l-t injektáltunk a fordított fázisú, 5 m szemcseméretű, 100 x 2,1 mm méretű Hypersil ODS analitikai oszlopra. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk:

A: víz, 0,1% trifluor-ecetsav (TFA)

B: víz, 20% acetonitril (ACN), 0,1% TFA

Az elválasztás a 3. táblázatban található gradiens programmal történt. Az áramlási sebesség az analízis során 0,5 ml/perc, az oszlophőmérséklet 25C, a mintatér hőmérséklete 6C volt.

A fitokelatinok mennyiségi meghatározása „post-column” származékképzéssel történt, a következő összetételű Ellman reagenssel: 50 mM Na-foszfát puffer (pH 8), 10% ACN és 74,5 M DTNB. A reagens áramlási sebessége 1,5 ml/perc volt. A reagens és a minta egy 20 cm hosszú és 1 mm átmérőjű tefloncsőben keveredett. A származékképzés után az elegy abszorbanciáját 410 nm-en mértük az UV detektorral.

3. táblázat A fitokelatinok HPLC analízise során használt gradiens program.

	Idő (perc)	A%	B%
1	0	100	0
2	2,5	75	25
3	17,5	0	100
4	18	0	100
5	19	100	0
6	25	100	0

A 2 -Glu-Cys dipeptid egységet tartalmazó fitokelatinok [PC2; (-Glu-Cys)₂-Gly] koncentrációját a GSH-ra felvett kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg. A fitokelatin-szintáz specifikus aktivitását a képződött PC2 nmól mg^-1 fehérje min^-1 egységre adtuk meg. A minták fehérjetartalmát a 4.5. pont alatt leírt módszerrel mértük.