Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

4.9. Szalicilsav extrakció és mennyiségi analízis

A szalicilsav HPLC-s analízisét Meuwly és Métraux (1993) által leírt módszer szerint végeztük, mellyel az alábbi vegyületeket lehet kimutatni: benzoesav, fahéjsav, orto-hidroxi-fahéjsav és szalicilsav. A 1,5 g növényi mintát folyékony nitrogénben, 0,75 g kvarchomok hozzáadásával dörzsmozsárban eldörzsöltük. A homogenátumot centrifugacsövekbe öntöttük és 2 ml 70%-os metanolt adtunk hozzá, mely 250 ng orto-anizinsavat (o-ANI: belső standerdként használva) és 25 g para-hidroxi-benzoesavat (p-HBA: extrakciós karrierként használva) tartalmazott. Az extraktumot 10000 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, 2 ml 90%-os metanollal a csapadékot újra extraháltuk, majd utána 10000 g-vel 20 percig cetrifugáltuk. Az így képződött felülúszót az előzőekben félretetthez öntöttük. Ezzel az eljárással a növényben lévő szabad vegyületeket illetve a kötöttek közül a metanolban oldódókat lehet kinyerni.

Az összegyűjtött felúszókat vákuumbepárlóban vizes fázisig bepároltunk, majd 1 ml 5%-os (w/v) TCA-t mértünk hozzájuk. Vortexelést követően 13000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszókat kétszer 2,5 ml ciklohexán: etilacetát = 1:1 (v/v) elegyével particionáltuk. A felső szerves fázis a szabad fenolos vegyületeket, míg az alsó vizes fázis a metanolban oldódó kötött fenolos vegyületeket tartalmazta. A felső szerves fázist Pasteur pipettával üvegfiolákba helyeztük át és mérésig −20°C-on tároltuk.

A kötött fenolos vegyületek savas hidrolízise a következőképpen történt. Az alsó vizes fázishoz 250 l 0,1 mg/ml p-HBA-t, 5 l 0,05 mg/ml o-ANI-t és 1,3 ml 8N HCl-t adtunk és 80°C-on 60 percig inkubáltuk. Majd a fent leírt módon kétszer particionáltuk, és a felső szerves fázisokat felhasználásig –20°C-on tároltuk.

A HPLC analízis előtt a képződött mintákat vákuumbepárlóban szárazra pároltuk, majd az „A” szolvens 900 l-ében visszaoldottuk. A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumpa rendszer, (mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert) UV/VIS diódasoros detektor (W996) és egy W474 scanning fluoreszcens detektor. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt.

A mintából 40 l-t injektáltunk az 5 m szemcseméretű, 150 x 4,6 mm méretű Supelcosil ABZ Plus analitikai oszlopra. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk:

A: 25 mM Na-acetát (pH 2,6), 15% ACN

B: 100% ACN.

Az elválasztás a 4. táblázatban található gradiens programmal történt. Az oszlophőmérséklet az analízis során 40C volt.

4. táblázat A benzoesav, o-hidroxi-fahéjsav és szalicilsav HPLC analízise során használt gradiens program.

	Idő (perc)	Áramlási sebesség (ml/perc)	A%	B%
1	0	1	100	0
2	1	1	100	0
3	3	1	95	5
4	5	1	95	5
5	18	1	45	55
6	20	1	0	100
7	20,1	1,4	0	100
8	25	1	0	100
9	27	1	100	0
10	31	1	100	0

Detektáláshoz a diódasoros UV/VIS detektorral 230 és 300 nm között teljes spektrumot vettünk fel, melynek egyik célja az, hogy minden vegyületet a maximális abszorbanciánál tudjunk kiértékelni, másrészt a jellemző UV spektrum alapján is lehet azonosítani a csúcsot a retenciós idő mellett (benzoesav, orto-hidroxi-fahéjsav, szalicilsav és transz-fahéjsav). A vizsgált vegyületek közül az orto-hidroxi-fahéjsav és a szalicilsav fluoreszkál is. Detektálásuk 317 nm gerjesztési és 436 nm kisugárzási (o-HCA), illetve 305 nm gerjesztési és 407 nm kisugárzási hullámhosszon (SA) történt.

A mintavétel a kadmiumos kezelés negyedik és hetedik napján történt, a kezeletlen illetve kezelt növények harmadik leveléből és a gyökérből.