Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

6. AZ EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA

6.1. Kadmiumkezelés hatásának vizsgálata kukoricában

Jelen dolgozatban az egyik legveszélyesebb nehézfém, a kadmium hatásait vizsgáltuk kukoricanövényekben. Korábbi kísérleteink során már tapasztaltuk, hogy a kadmium döntően a gyökérben akkumulálódik, mivel ez az első szerv, ami kapcsolatba kerül a talajban a nehézfémmel (Pál és mtsai, 2002). A kadmium viszont a hajtásba is transzlokálódik, 100 M-os Cd kezelés hatására 48 óra elteltével, a kukorica legfiatalabb leveleiben nagy mennyiségben jelent meg a kadmium (Szalai és mtsai, 2002).

6.1.1. Kadmiumkezelés okozta oxidatív stressz vizsgálata három stresszmarker segítségével

A kadmium reaktív oxigén molekulák képződését indukálva oxidatív stresszt és lipidperoxidációt okoz a kukoricanövényekben (Prasad, 1995a; Sanita di Toppi és Gabbrielli, 1999; Pál és mtsai, 2006a). Munkánk első részében tanulmányoztuk a 10, 25 és 50 M koncentrációban alkalmazott kadmium indukálta oxidatív stresszt a 10 napos kukoricanövényekben, mely a klorofilltartalom, a klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter, és a lipidperoxid-szint változásaiban manifesztálódott.

Az általunk végzett kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy a legmagasabb alkalmazott kadmiumkoncentráció (50 M) 7 nap elteltével jól látható klorózist váltott ki. A klorofilltartalom a negyedik naptól csökkent 10, 25 és 50 M kadmium jelenlétében (5. táblázat) (Pál és mtsai, 2005). Számos irodalmi adat van arra vonatkozólag, hogy a kadmium csökkenti a levél össz klorofill- és karotinoidtartalmát kukoricában (Prasad, 1995b; Ekmecki és mtsai, 2007; Krantev és mtsai, 2008), továbbá hatása eltérő a különböző korú levélszegmensekben (Drazkiewicz és Baszynski, 2005). A kadmium klorofilltartalom csökkentő hatása az irodalomban jól tanulmányozott és azzal magyarázható, hogy a kadmium a klorofill bioszintézis több lépését is gátolja (Böddi és mtsai, 1995; Parekh és mtsai, 1990).

Vizsgálataink során, a 25 és 50 M koncentrációjú kadmiumkezelés is képes volt csökkenteni a PSII kvantumhatásfokát jellemző F/F_m’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paramétert 7 nap elteltével (3. ábra) (Pál és mtsai, 2005). Hasonló ereményeket kaptunk korábbi munkánk során, ahol 1 nap eltelével az 500 M-os kadmium kezelés 29%-kal csökkentette a F/F_m’ értékét (Pál és mtsai, 2002). Más eredmények szerint 300 M-os kadmiumkezelés nyolc nap elteltével a F/F_m’ és az F_v/F_m értékeket is csökkentette kukoricában (Ekmekci és mtsai, 2008). 14 napos kukoricanövényekben, 100 M koncentrációban a kadmium nem befolyásolta az F_v/F_m klorofill fluoreszcencia indukciós paramétert, de 0,5 mM, illetve 1 mM koncentrációban 48 óra elteltével már erőteljesen csökkentette (Szalai és mtsai, 2002). Ezutóbbi eredmény arra enged következtetni, hogy kadmiumstressz esetében a F/F_m’ paraméter érzékenyebbnek bizonyulhat.

A fotoszintézis folyamata nagyon érzékeny a nehézfémekre. A kadmium a Calvin-ciklusra gyakorolt gátló hatása mellett, mind a PSII mind a PSI aktivitását csökkenti, bár hatása utóbbira kisebb. Gátló hatását a PSII redukáló és oxidáló oldalán (vízbontó komplex) is kifejti. Nemcsak az antenna méretét, hanem az aktív reakció centrumok arányát is csökken a PSII-ben (Clijsters és van Assche, 1985; Atal és mtsai, 1991). A fotoszintetikus apparátus módosulásával, vagy károsodásával a legfontosabb fotoszintetikus pigment a klorofill-a jellemzői is megváltoznak. Ezért a klorofill fluoreszcencia analízis széleskörben elterjedt, gyors, in vivo alkalmazható módszer, habár nagymértékben befolyásolja a pigmenttartalom és a levél fotoszintetikus képessége (Gitelson és mtsai, 1999).

A lipidperoxidáció mértékének meghatározására a malondialdehid mennyiségében bekövetkező változásokat mértük. A MDA tartalom a kukoricanövények levelében a kezelés 4. napjától már 10 M kadmium jelenlétében is megemelkedett (6. táblázat) (Pál és mtsai, 2005). Az általunk kapott eredményeket más szerzők is megerősítették. Krantev és mtsai (2006) 10, 12 és 25 M-os kadmiumkezelés hatására megnövekedett elektrolit kiáramlást és MDA tartalmat mértek, mely jelzi, hogy a kadmium lipidperoxidációt indukált a kukoricanövények levelében.

A gyökérben a kadmiumkezelés nem volt hatással az MDA szintjére (6. táblázat) (Pál és mtsai, 2005). Az eredmények azt mutatják, hogy az alkalmazott kadmiumkoncentrációk oxidatív stresszt indukáltak a kukoricalevélben, de ezt a gyökérben nem tudtuk kimutatni. Tudjuk, hogy a kadmium magasabb (500 M) koncentrációban csökkenti a gyökér életképességet (Pál és mtsai, 2002). Elképzelhető, hogy a gyökér MDA tartalom változásához az általunk alkalmazott alacsonyabb koncentrációk esetében hosszabb idejű kitettség szükséges. Hegedűs és mtsai (2001) által kapott eredmények ezt a következtetést támasztják alá, mivel a 300 M-os kadmiumkezelés árpanövény levelében megemelte az MDA szintjét, de a gyökérben csak magasabb koncentrációjú, 1 mM-os kadmiumkezelés váltotta ki az MDA tartalom növekedését. Xu és mtsai (2008) fokhagyma esetében is azt tapasztalták, hogy a levélben a kadmium már 10 M-os koncentrációban megemelte az MDA szintet, míg ez a gyökérben csak 1 mM koncentrációnál következett be.

• 
  Munkánk során kimutattuk, hogy az általunk vizsgált kísérleti körülmények között, a kadmiumkezelésre a kukoricanövény levele és gyökere eltérő módon reagált. Míg a levélben a kadmium oxidatív stressz indukált, amit a klorofilltartalom, a klorofill-a indukciós paraméter csökkenése és az MDA tartalom megemelkedése kísért, addig a gyökérben nem volt kimutatható a MDA szint változása.
  

6.1.2. Kadmiumkezelés hatása a membránok lipid összetételére

A kadmium számos élettani folyamatot (növekedés, életképesség, fotoszintetikus és légzési elektrontranszport, membránokhoz kötött enzimek aktivitása) gátol a növényekben, mely szoros összefüggésben van a kadmium membránokra gyakorolt hatásával (Sanita di Toppi és Gabbrielli, 1999; Prasad, 1995a). A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogyan milyen változásokat indukál a kadmiumkezelés a különböző lipidfrakciók zsírsavösszetételében, illetve hogyan változik a lipidfrakciók telítetlensége, ezáltal a membránpermeabilitás. Az általunk vizsgált lipidfrakciók a következők voltak: MGDG, PE, PG és DGDG.

A kontroll növények levelében, a MGDG és DGDG frakciókban a többszörösen telítetlen 18:3 mennyisége magas volt (MGDG: 94%, DGDG: 83%), amit a kadmiumkezelés nem befolyásolt. Azonban a kadmiumkezelés hatására a levél PE és PG frakcióiban a zsírsavak aránya hasonló módon változott. Mindkét frakcióban csökkent a 16:0 mennyisége, míg a 18:2 mennyisége megemelkedett. A 18:3 szintje alacsonyabb Cd koncentrációknál megemelkedett a PE (25 M), és a PG (10 és 25 M) frakciókban is, de a magasabb (50 M) koncentrációnál a PG frakcióban csak kisebb mértékben, illetve a PE frakcióban csökkenést tapasztaltunk a kontrollban mért értékhez képest. A DBI és telítetlenségi százalék értéke mindkét frakcióban az alacsonyabb kadmiumkoncentrációknál emelkedett nagyobb mértékben (3. táblázat).

A t16:1 szintje, mely csak a levél PG frakcióban detektálható, valamennyi kadmiumkoncentráció jelenlétében csökkent (3. ábra) (Pál és mtsai, 2007).

Az általunk tapasztaltakhoz hasonló változásokat indukált kukoricában az ólom, mivel a rövid szénláncú, telített zsírsavak mennyisége csökkent, míg a 18:3 szintje megemelkedett (Stefanov és mtsai, 1995). Szintén kukoricában az alumínium megemelte a PG és MGDG frakciók 18:1 szintjét, a foszfatidil-inozitol (PI) és PE frakciók 18:2 szintjét, valamint a PI, foszfatidil-kolin, PG, MGDG frakciókban a 18:3 arányát, és ezen változásokkal összhangban nőtt a DBI, és a membránpermeabilitás. A többszörösen telítetlen zsírsavak felhalmozódásával párhuzamosan az alumínumkezelés hatására csökkent a MGDG, PG, PI és PE frakciókban a 16:0 mennyisége, a PG frakcióban a t16:1 mennyisége, valamint a foszfatidil-kolin és DGDG frakciókban a 18:0 aránya és a PI és foszfatidil-kolin frakciókban a 18:1 aránya (Chaffai és mtsai, 2005). Kukoricanövényeket rézzel kezelve a következő változásokat tapasztalták: a hajtásban a foszfatidil-kolin, a szulfokvinovozil-diacilglicerol (SQDG) és a MGDG frakciók kettőskötés indexe megemelkedett, míg ugyanez a PI és PG frakciókban csökkent (Chaffai és mtsai, 2007a). Legutóbbi eredmények pedig arról számolnak be, hogy 100 M kadmium a kukorica hajtásában csökkentette a telítetlenségi szintet a foszfatidil-kolin és PG frakciókban, de megemelte a SQDG, MGDG és DGDG frakcióban (Chaffai és mtsai, 2007b). Az MGDG, DGDG és SQDG frakciók a kloroplasztiszok tilakoid membránjainak fontos komponensei. A magas telítetlenségi szint a tilakoid membránokban elengedhetetlen a fluiditás, valamint a lipidmolekulák megfelelő geometriájának fenntartásához. Nehézfémstressz során a megemelkedett telítetlenségi szint szerepet játszhat a növény túlélésében, így a nehézfémstressz ellenére is tapasztalt növekedésben (Chaffai és mtsai, 2007a;b).

A 18:3 szint, a DBI és a telítetlenségi százalék eltérő változásai alacsonyabb és magasabb kadmium koncentrációk mellett arra utalnak, hogy míg az alacsonyabb koncentrációjú kadmiumkezelés védekező mechanizmusokat indukál és nő a membránpermeabilitás, addig magasabb koncentrációban a kadmium membránkárosodást okoz. A 18:3 mennyiségének csökkenése összefüggésben lehet a reaktív oxigén molekulák és a telítetlen zsírsavak közvetlen reakciójával, illetve a kadmium gátolhatja a zsírsav deszaturáz aktivitást (Nouairi és mtsai, 2006). Másrészről a kadmium fokozza a lipidperoxidációért felelős lipoxigenáz aktivitást, mely reakciónak különösen a telítetlen zsírsavak a szubsztrátjai (Thompson és mtsai, 1998).

A PG frakciónak nélkülözhetelen szerepe van a fotoszintetikus membránok fehérje organizációjában, mivel részt vesz a fénygyűjtő komplex oligorimerizációjában és a PSII dimerizációjában (McCourt és mtsai, 1985; Krupa és mtsai, 1987; Kruse és mtsai, 2000). A t16:1 szint csökkenése összefüggésben van a PSII fénygyűjtő komplexének (LHCII) kadmium indukálta károsodásával (Krupa, 1988). A t16:1 szint csökkenését írták le búzában hideg edzés során Szalai és mtsai is (2001).

Számos növényfaj esetében azonban, a nehézfémek hatására csökken a többszörösen telítetlen zsírsavak képződése (Harwood, 1998). Brassica napus leveleiben csökkent a 18:3 és a t16:1 aránya is (Nouairi és mtsai, 2006), paradicsom levelében pedig a 16:0 aránya megemelkedett szinte minden lipid frakcióban, míg a 18:2 és 18:3 aránya csökkent (Ouariti és mtsai, 1997). Az alacsonyabb telítetlen zsírsav arány és a DBI értékeknek szerepe lehet abban, hogy nehezíti a nehézfémek felvételét (Chaffai és mtsai, 2005). Irodalomból ismert hogy a stressz toleráns növényekben a membrán telítetlensége, különösen a 18:3 mennyisége megemelkedik alacsony hőmérsékleti, só stressz és patogén támadást követően, ellenben magas hőmérsékleti és nehézfémkezelés hatására csökken. Továbbá a nehézfémérzékenység a plazmamembránok telítetlenségével párhúzamosan nő (Upchurch, 2008).

A kontroll növények gyökerében a 16:0 (25-63%-ban) és a 18:2 (26-65%-ban) zsírsavak domináltak az összes általunk vizsgált lipidfrakcióban. A többszörösen telítetlen zsírsavak aránya jóval alacsonyabb volt, mint a levélben, így kifejezettebb változásokat tapasztalhattunk. A gyökérben a 16:0 zsírsav mennyisége az MGDG frakció kivételével valamennyi vizsgált lipidfrakcióban csökkent a kadmiumkezelést követően. A 18:0 és 18:1 szintje az MGDG és PG frakciókban valamennyi kadmiumkoncentráció esetében csökkent, míg a PE és DGDG frakcióban, igaz csak a legmagasabb (50 M-os) koncentráció jelenlétében, de megemelkedett. A kadmiumkezelés növelte a 18:2 arányát az MGDG, PG és DGDG frakcióban, és a 18:3 arányát az MGDG és PE frakciókban. A MGDG és DGDG frakciókban a DBI és a telítetlenségi százalék értéke főleg az alacsonyabb Cd koncentrációjú kezelés során nőtt. Ez utóbbi változások hasonlóak ahhoz, amit a levélben a PE és PG frakciók esetében tapasztaltunk, és a magasabb kadmiumkoncentráció károsító hatásával magyarázható (4. táblázat) (Pál és mtsai, 2007).

Mind rézzel, mind kadmiummal kezelt kukoricanövények esetében azt tapasztalták, hogy a telítetlen zsírsavak aránya és a poláris lipidek mennyisége megemelkedett, továbbá a megemelkedett szterol/foszfolipid arány, és az MGDG/DGDG arány csökkenése, valamint lipidperoxidáció indukciója azt mutatja, hogy a kadmiumkezelés membránkárosodást okozott gyökerben (Chaffai és mtsai, 2007a,b). Paprika és paradicsom növények gyökerében azonban azt tapasztalták, hogy a kadmiumkezelés nem befolyásolta a zsírsav összetételt (Jemal és mtsai, 2000; Verdoni és mtsai, 2001).

• 
  Vizsgálataink azt mutatták, hogy a kadmiumkezelés kukorica levelében a PG és PE, míg a gyökérben valamennyi vizsgált lipidfrakcióban változást indukált. Megállapíthatjuk, hogy rövid szénatomszámú, telített zsírsavak mennyiségének csökkenésével nőtt a hosszabb szénatomszámú, telítetlen zsírsavak aránya, amit a DBI és a telítetlenségi százalékértékek változásai is jól mutatnak. A többszörösen telítetlen zsírsavak mennyiségével arányosan a membrán fluiditása megemelkedik, és ez felelős lehet a kadmium gyors felvételéért és transzlokálódásáért kukoricában. A magasabb kadmiumkoncentrációknál a lipidfrakciók telítetlenségének növekedésében bekövetkező visszaesés, a membránfluiditás növekedésének kadmium általi gátlásából adódhat.