Kadmium által indukált élettani változások kukoricában pál magda

6.2. Kadmiumstressz hatására indukálódó védekező mechanizmusok

6.2.1. Antioxidáns enzimek aktivitásának változásai

Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy a kadmium koncentráció-függő módon megnövelte a 4. naptól a GR (7. ábra), és a 7. napon a POD aktivitását (8. ábra) a kukoricalevélben, de nem befolyásolta a KAT, APX és GST aktivitásokat. Ezen eredmények hasonlóak más szerzők által leírtakhoz, ahol kukoricalevélben kadmiumkezelés hatására POD aktivitásnövekedést tapasztaltak (Lagriffoul és mtsai, 1998; Kong és mtsai, 1999). A legújabb irodalmi adatok szintén megerősítették a kadmium POD enzim aktiváló hatását (Krantev és mtsai, 2006; Kumar és mtsai, 2008), sőt Ekmekci és mtsai (2008) már egészen alacsony, 0,3 − 0,9 -os kadmiumkoncentráció esetében is erre az eredményre jutottak. A kadmium GR aktivitását növelő hatását 500  kadmiummal kezelt kukoricalevélben, korábbi eredményeink során már leírtuk (Pál és mtsai, 2002), ehhez hasonló eredményekre jutottak más szerzők is (Yannarelli és mtsai, 2007; Ekmekci és mtsai, 2008). Az irodalomból ismert továbbá, hogy kukoricában kadmiumkezelés hatására nő az APX (Krantev és mtsai, 2006; Ekmekci és mtsai, 2008; Kumar és mtsai, 2008) valamint a KAT (Kumar és mtsai, 2008) aktivitás. Míg mások KAT aktivitás csökkenését (Kong és mtsai, 1999) tapasztalták kukoricában, vagy hogy a kadmium nem befolyásolta a KAT aktivitást (Krantev és mtsai, 2006). Figyelembe kell azonban venni azt is, hogy az antioxidáns enzimek aktivitása a növény öregedésével is emelkedhet (Abarca és mtsai, 2001), ahogy azt a kukoricalevélben mi is tapasztaltuk a POD és GR aktivitások esetében. Az eredmények összevetését más növényfajban tapasztaltakkal nehezíti, hogy az irodalmi adatok szerint a nehézfémek, az alkalmazott fémion típusától, koncentrációjától és a kezelt növényfajtól függően, eltérően befolyásolják az antioxidáns enzimek aktivitását (Sanita di Toppi és Gabbrielli, 1999; Gallego és mtsai, 1996).

Az általunk beállított kísérleti körülmények között a kadmiumkezelés nem befolyásolta jelentősen az enzimaktivitásokat a gyökérben, habár korábbi eredményeink során, 500  kadmiummal kezelt kukoricalevélben, 1 nap elteltével a POD aktivitás csökkent (Pál és mtsai, 2002). Ezen aktivitás csökkenés azzal magyarázható, hogy a kadmium ilyen magas koncentrációban már oxidatív stresszt indukál a gyökérben, és az enzimfehérjék károsodhatnak (Gallego és mtsai, 1996).

• 
  Ezen eredmények megerősítik korábbi megállapításunkat, mely szerint a kukoricagyökér és levél eltérőképpen reagál a kadmiumkezelésre. A levélben a kadmium oxidatív stresszt vált ki, melynek hatására a GR és a POD enzimek aktiválódnak, míg a gyökérben nem tapasztaltuk az antioxidáns enzimek indukcióját (Pál és mtsai, 2005).
  

6.2.2. Kéntartalmú vegyületek szerepe a kadmiumstressz elleni védelemben

Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy 1 napos kadmiumstresszet követően a levélben a cisztein mennyisége csökkent, de a 7. napon mennyisége a kontroll növényekben mért értékkel azonos volt (5. táblázat). A -EC esetében az első napon szintén visszaesés volt tapasztalható a kadmiumkezelés hatására, de a 4. naptól mennyiségét valamennyi alkalmazott koncentráció megemelte a kontrollhoz képest (6. táblázat). A GSH szintje az első napon a prekurzoraihoz hasonló változásokat mutatott, azaz csökkent, de a 7. napra mennyisége nem tért el a kontroll növényekében mért értékektől (7. táblázat) (Pál és mtsai, 2006b).

Eredményeinkhez részben hasonló megfigyeléseket tettek kukoricában más szerzők is. 3 M Cd 7 nap elteltével nem befolyásolta a ciszteintartalmat, növelte a -glutamil-cisztein mennyiségét a hajtásban, míg a glutationtartalom csökkent (Meuwly és Rauser, 1992). Souza és Rauser (2003) azt tapasztalta, hogy már 1 M Cd 15 nap elteltével kukoricanövényekben a GSH tartalmat a levélben megemelte, de a ciszteinszintet nem befolyásolta jelentősen a kezelés. Kadmiumkezelés során a csírázó kukoricaszemek GSH tartalmának növekedését is leírták (Klejdus és mtsai, 2004). Potesil és mtsai (2005) azt tapasztalták a GSH és GSSG tartalom megemelkedik a kadmium hatására (10 és 100 M), a ciszteinszint viszont csökken. Mások a kadmiumstressz során a cisztein és a -EC tartalom emelkedéséről számoltak be a levélben (Nocito és mtsai, 2002; Rüegsegger és Brunold, 1992), továbbá magasabb GSH szintet mértek levélben, a fitokelatinok akkumulációja ellenére is (Drazkiewicz és mtsai, 2003).

A fitokelatinok glutationból szintetizálódnak és szerepüket a kadmium detoxifikálásában, a fitokelatin, illetve a glutation szintézisére képtelen, kadmiumra érzékeny cad1 és cad2 Arabidopsis mutánsokkal végzett kísérletek bizonyítják (Howden és mtsai, 1995a,b; Cobbett és mtsai, 1998). A kadmiumkezelés egyik alkalmazott koncentrációban sem befolyásolta az in vivo fitokelatinszintet a levélben (8. táblázat), ellenben az in vitro fitokelatin szintáz aktivitás a kadmiumkezelés hatására szignifikánsan megemelkedett, a negyedik naptól valamennyi kadmiumkoncentráció esetében (9. táblázat) (Pál és mtsai, 2004).

A kadmiumkezelés a levélben tapasztaltakkal szemben a következőképpen befolyásolta a gyökér tioltartalmát. A cisztein mennyisége nem változott egyik koncentráció esetében sem a vizsgált napokon, a -EC szintje az első napon csökkent, de a 4., illetve 7. napon megemelkedett, míg a GSH mennyisége valamennyi vizsgált napon csökkent 10, 25 és 50 M kadmium jelenlétében (5.-7. táblázat)(Pál és mtsai, 2006b).

Más szerzők is hasonló eredményeket kaptak a kukoricagyökér GSH és prekurzorainak mennyiségi vizsgálata során. 3 M Cd 7 nap elteltével nem befolyásolta a ciszteintartalmat, növelte a -glutamil-cisztein mennyiségét, míg a glutationtartalom csökkent a gyökérben (Meuwly és Rauser, 1992). Már 1 M Cd 15 nap elteltével csökkentette a GSH tartalmat a gyökérben, a cisztein szintet nem befolyásolta jelentősen a kezelés, míg a -EC koncentrációja megemelkedett (Souza és Rauser, 2003). 6 M kadmium szintén kukoricagyökérben megemelte a GSH szintet, míg nem befolyásolta a GSSG szintet, de 30 M-os koncentrációban GSH tartalom csökkent, a GSSG pedig nőtt (Rellán-Álvarez és mtsai, 2006). Megint mások arról számoltak be, hogy kadmiumstressz során a cisztein és a -EC tartalom megmelkedett, a GSH tartalom csökkent a gyökérben (Nocito és mtsai, 2002; Rüegsegger és Brunold, 1992).

Az in vivo fitokelatinszint a gyökérben az első naptól megemelkedett 10, 25 és 50 M kadmium jelenlétében a kontrollhoz képest (8. táblázat). Az alacsonyabb koncentrációk esetében (10 és 25 M) ez az emelkedés nagyobb mértékű volt, valamennyi vizsgált napon. A gyökér in vitro fitokelatin szintáz aktivitásában a negyedik naptól csökkenést tapasztaltunk (9. táblázat) (Pál és mtsai, 2004).

A GSH mennyiségének drasztikus csökkenése a gyökérben érthető, hiszen a GSH a fitokelatinok prekurzora, és ahogy azt mi is tapasztaltuk, a fitokelatinok (PC2) szintézise a gyökérben a kadmiumkezelés során már az első naptól megemelkedett. Eredményeinket más irodalmi adatok is megerősitik. Kadmiumnak kitett kukoricanövények gyökerében a fitokelatinok néhány óra elteltével megjelentek, és a fitokelatinok intenzív akkumulációjával párhuzamosan a glutationszint drasztikusan lecsökkent (Meuwly és Rauser, 1992, Wójcik és Tukendorf, 1999, Tukendorf és Rauser, 1990). A GSH szint csökkenésével a -EC szintetáz felszabadulhat a GSH okozta feedback gátlás alól, és ez megmagyarázhatja a -EC szint megemelkedését. Ezen kívül a -EC akkumuláció másik lehetséges magyarázata lehet a kadmium eltérő hatása a -EC szintetázra és a GSH szintetázra, mivel utóbbit a kadmium nagyobb mértékben gátolja (Hell and Bergmann 1990).

A magasabb koncentráció (50 M) esetében tapasztalt alacsonyabb PC2 szint a gyökérben azzal magyarázható, hogy nagyobb koncentrációban illetve hosszabb idejű kitettség esetén már valószínűleg a magasabb tagszámú, általunk nem vizsgált fitokelatinok mennyisége emelkedhetett meg (Pál és mtsai, 2004). Ezt irodalmi adatok is alátámasztják, mivel 0,05 M kadmium 24 óra elteltével indukálta a PC szintézisét a kukorica gyökerében, és 3 M Cd hatására 2 óra elteltével főleg a 2−4 tagszámú fitokelatinok jelennek meg, míg 6 óra múlva a PC2 helyett már a PC3 dominál (Tukendorf és Rauser, 1990).

A fitokelatinok megjelenése a nehézfémstressz egyik korai figyelmeztető jele a növényekben (Keltjens és van Beusichem, 1998). Gyors akkumulációjuk feltételezi, hogy a PCS enzim folyamatosan jelen van a növények gyökerében (Grill és mtsai, 1989). Míg Reese és mtsai (1992) azt tapasztalták, hogy az enzim csak a kadmiumnak kitett paradicsomnövények levelében szintetizálódott. Eredményeink hasonló következtetésre vezethetnek minket, mivel a kukoricalevélben kismértékű PCS aktivitásokat mértünk, és feltételezhetően ez nem elegendő ahhoz, hogy az in vivo PC2 szintet megemelje. Az általunk is tapasztalt aktivitás gátlás a kukorica gyökerében kadmium jelenlétében azzal magyarázható, hogy a PC-ok szintézise önszabályozó módon történik, ahogy a reakció terméke (PC) kelátot képez a nehézfémmel, a PCS az aktiváló nehézfém hiányában inaktivvá válik (Loeffler és mtsai, 1989). Kísérletünkben a gyökér in vivo PC szintje már az első naptól megemelkedett, így feltételezhető, hogy a reakcióelegyben jelenlévő fitokelatinok kelátot képeztek a kadmiummal, és a kontrollhoz képest alacsonyabb PCS aktivitások mértünk a kadmiummal kezelt növények gyökerében (Pál és mtsai, 2004). Hasonló eredményeket kaptak szintén kukoricában Szalai és mtsai (2002), ahol 100 M kadmium már 1 óra elteltével serkentette a PCS aktivitást a levélben, és 48 óra elteltével gátolta a gyökérben.

• 
  Megállapíthatjuk, hogy a kadmiumkezelés nem volt kifejezetten hatással a levél és gyökér cisztein, valamint a levél GSH tartalmára, de számottevően megemelte a -EC koncentrációját a levélben és gyökérben is. A gyökér GSH szint csökkenése a kadmiumkezelés során idő- és koncentrációfüggő volt. A kadmiumkezelés hatására az in vivo PC2 szint megemelkedett a kukorica gyökerében. A megemelkedett fitokelatinszint felelős lehet a kadmium hatékony detoxifikálásában, vakuoláris kompartmentalizációjában a gyökérben. A gyökérben a kontrollhoz képest tapasztalt in vitro PCS aktivitás csökkenés, a fitokelatinok gyors akkumulációjával magyarázható. Eredményeink megerősítik azt a feltételezést, hogy míg a gyökérben a PCS enzim jelenléte konstans, addig a levélben a kadmium jelenléte szükséges a szintézisének indukciójához.
  

6.2.3. A szalicilsav és más fenolos vegyületek szerepe a kadmiumstressz elleni védelemben

Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy kezdetben a kontroll növények levelei mind kötött, mind szabad formában kismennyiségű BA-t, SA-t és o-HCA-t tartalmaztak (13-15. ábra). A magasabb (25 és 50 M) kadmiumkoncentrációk megközelítőleg háromszorosára emelték a szabad és kötött BA és SA szintjét, mindkét esetben a kötött forma akkumulációja volt nagyobb. Ezen kívül a BA mennyisége (szabad és kötött formában is) nagyságrenddel nagyobb volt a SA-hoz képest. A kötött BA felhalmozódása, a szabad forma gyors konjugációját jelezheti. Dohányban kimutatták, hogy a konjugált BA sokkal valószínűbb direkt prekurzora a SA-nak, mint a szabad formája (Chong és mtsai, 2001). Azonban az ilyen nagymértékű kötött BA felhalmozódás adódhat a SA bioszintézis alacsony mértékéből is. A kadmiummal kezelt növények leveleiben o-HCA felhalmozódást is mértünk. A fenolos vegyületek között a kötött o-HCA mennyisége emelkedett meg legnagyobb mértékben a kezelés során, és 2 nagyságrenddel nagyobb volt a szabad formájához képest (Pál és mtsai, 2005).

A gyökérben a kötött BA szint kismértékben csökkent (16. B ábra), a szabad o-HCA mennyisége jelentősen nőtt (18. ábra) 50 M Cd jelenlétében. Habár a gyökér kötött BA szintje a levélben mért értékekkel azonos nagyságrendbe esett, addig a szabad BA mennyisége majd 1 nagyságrenddel magasabb volt a levélhez viszonyítva. A kadmiumkezelés nem befolyásolta jelentősen a szabad és kötött SA koncentrációját, és a mennyisége mindkét formában, a levélben mért értékekhez hasonló volt. A gyökérben a kötött o-HCA mennyisége a kimutathatósági határ alatt volt.

A szalicilsav, mint endogén szignál molekula a növényi patogenezisben betöltött szerepe (Alvarez, 2000) mellett részt vesz az abiotikus stressz indukálta növényi válasz jelátviteli folyamatában. Az irodalmi adatok alapján összegezve megállapíthatjuk, hogy a külsőleg adott szalicilsavnak különböző abiotikus stresszek ellen védő hatása van. Alacsony koncentrációban (5 − 500 M) alkalmazva a szalicilsav átmeneti oxidatív stresszt okoz a növénynek, és ez, mint egy edzési folyamat, védekező mechanizmusokat indukál. Köztudott, hogy a szalicilsav kezelés a növény antioxidatív kapacitását megnöveli, illetve stabilizáló anyagok, pl. poliaminok szintézisét indukálja. Tehát a szalicilsav számos védő mechanizmust indukál, de magasabb szalicilsav koncentráció olyan mértékű oxidatív stresszt okoz, mely a hiperszenzitív reakcióhoz hasonló sejtelhaláshoz vezet.

Szalicilsav kezelés csökkenti a nehézfém toxicitást is több növényfajban (Yang és mtsai, 2003; Metwally és mtsai, 2003). Korábbi kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy 1 napos 500 M-os szalicilsavas kezelés kukoricában, 1 nappal a kadmiumkezelés előtt, illetve azzal párhuzamosan alkalmazva csökkentette annak klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméterre gyakorolt hatását, valamint a kadmiumtartalmat. Azonban a szalicilsavas kezelés önmagában is, de a kadmiummal együtt alkalmazva még kifejezettebben csökkentette a gyökér életképességét. Tehát a szalicilsav gátolta ugyan a kadmiumfelvételt, de elősegítette annak károsító hatását (Pál és mtsai, 2002). Ugyanakkor szintén kukoricában mutatták ki, hogy a magok 500 M-os szalicilsavban 6 órán keresztül történt áztatása védelmet nyújtott a 10, 15 és 25 M Cd-kezelés hatásaival szemben. Csökkentette annak növekedésgátló, klorofilltartalom csökkentő hatását, a ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz és foszfoenolpiruvát-karboxiláz enzimre gyakorolt gátló hatását, valamint csökkentette a prolinprodukciót, lipidperoxidációt és az elektrolit kiáramlást (Krantev és mtsai, 2008).

Számos növényben eredményeinkhez hasonlóan a nehézfémionok szalicilsav felhalmozódást indukáltak (Yang és mtsai, 2003; Metwally és mtsai, 2003; Rodriguez-Serrano és mtsai, 2006; Krantev és mtsai, 2008), ami a szalicilsav jelentőségét támasztja alá a növény nehézfémmel szennyezett környezetben való túlélésének segítésében.

Yalpani és mtsai (1993) dohánynövényekben tapasztalt eredményeik alapján a SA szint szabályozásának komplex képét alkották meg. Dohányban a SA jelentős része a BA-ból szintetizálódik. Kezdetben, az egészséges levelekben a szalicilsav koncentrációja, mind szabad, mind kötött formában nagyon alacsony, de az egészséges szövetekben a BA nagy mennyiségű készlete van jelen, könnyen hidrolizálódó, konjugált formában. A dohánymozaikvírus fertőzést követően, a kötött BA mennyisége átmenetileg csökkent, ezzel párhuzamban a szabad BA- és SA-szint megemelkedett. Ez azt valószínűsíti, hogy a kötött formából felszabaduló szabad BA a gyors SA képződés forrása. Ezzel összhangban van az is, hogy a megemelkedett BA koncentráció indukálta a BA-2-hidroxilázt, tovább stimulálva a SA szintézist (Leon és mtsai, 1995b), habár a SA szint növekedése aktiválja a SA glükozil-transzferázt, ami a SA konjugációjához vezet (Yalpani és mtsai, 1992).

Kevés adat áll rendelkezésre, arra vonatkozólag, hogy abiotikus, illetve nehézfémstressz során a szalicilsav szintézise milyen útvonalon történik. Ezért különösen érdekes a szalicilsav felhalmozódás vizsgálata mellett, a szalicilsav lehetséges prekurzorainak mennyiségi meghatározása. Mivel a gyökérben csak szabad formában jelenlévő o-HCA mennyisége a gyökér BA- és SA-tartalomhoz képest jóval kisebb, továbbá a szabad o-HCA mennyisége a legmagasabb kadmium koncentráció esetében megemelkedett, míg a szalicilsav szintje nem változott, feltételezhetően az o-HCA nem prekurzora a szalicilsavnak kukoricában kadmiumstressz során. Eredményeink azt mutatják, hogy az o-HCA levélben és gyökérben is tapasztalt akkumulációja a SA szintézistől függetlenül indukálódik, de mivel az o-HCA antioxidáns tulajdonsága az irodalomból ismert (Foley és mtsai, 1999), így felhalmozódása része lehet a növényben indukálódó antioxidáns stresszválasznak (Pál és mtsai, 2005).

Irodalomból ismert, hogy a szalicilsav hatással van az antioxidáns rendszerre, mivel gátolja a katalázt, de stimulálja peroxidázokat és serkenti a glutation produkciót (Chen és mtsai, 1993; Rao és mtsai, 1997; Srivastava és Dwivedi, 1998). Janda és mtsai (1999) leírták, hogy kukoricában a szalicilsavas előkezelés hatására a POD aktivitás megemelkedett, az exogén szalicilsav szintén megemelte a GR aktivitást mustárban (Dat és mtsai, 1998a). Szintén kukoricában 0,5 mM-os szalicilsavas kezelés megemelte a GR aktivitást a levélben, valamint a POD és APX aktivitásokat a gyökérben (Pál és mtsai, 2002). Ugyanakkor árpában az exogén szalicilsav a kadmiumtoxicitást csökkentette, de nem az antioxidáns rendszer szintjén, hanem más kadmium detoxifikáló rendszert indukálva (Metwally és mtsai, 2003). Mivel jelen kísérleti körülmények között az endogén szalicilsav-tartalom csak a kadmiumkezelés hetedik napján emelkedett meg, viszont a GR aktivitás már négy nap elteltével, nem valószínű, hogy a szalicilsav direkt szerepet játszik indukálásában, azonban ezt a POD esetében nem zárhatjuk ki. SA-előkezelt rizs gyökerekben a GSH és nem-fehérje típusú tiolok szintézisének fokozódását írták le (Guo és mtsai, 2009). Kísérletünkben az endogén szalicilsav-tartalom megemelkedése nem befolyásolhatta a cisztein, -EC, GSH, valamint PC2 mennyiségét, hiszen ez utóbbiakban tapasztalt változások már a SA felhalmozódás előtt bekövetkeztek.

• 
  A kukorica levele és gyökere a kadmiumkezelésre eltérően reagál. A kadmium a levélben BA, SA és o-HCA felhalmozódást indukált mind szabad, mind kötött formában, és a megemelkedett szalicilsav szintézis feltételezhetően benzoesavon keresztül történt. A gyökérben az 50 M-os kezelés drasztikusan megemelte a szabad o-HCA szintjét és kismértékben csökkentette a kötött BA szintjét. A levélben tapasztalt szalicilsav akkumuláció esetünkben inkább tekinthető a kadmium okozta oxidatív stressz részének, mint védekező mechanizmusnak, míg a levélben és a gyökérben is megfigyelt, szalicilsav szintézisétől független o-HCA felhalmozódás az antioxidáns védekező mechanizmus része lehet.