Toshkent farmatsevtika instituti ekologiya va mikrobiologiya kafedrasi kimyoviy mikrobiologiya fani bo

Virusologiyada qo’llaniladigan tekshiruv usullari.

D.I. Ivanovskiy chinni sham filtrlarni qo’llab viruslar olamini kashf qildi. Elektron mikroskopni kashf qilinishi, viruslarni ko’rish, ularning ultra strukturalarini o’rganishni ochib berdi. Gradient zichliklarda o’ta tez ultra sentrifugalarni qo’llash orqali viruslarning tozalangan preparatlarini olish imkoniyatini va ularning kimyoviy tarkibini o’rganishga olib keldi. Virusologiya fanini rivojlanishidagi asosiy omillardan biri, viruslarning o’stirib olish usullarini ishlab

chiqilganligi hisoblanadi. Viruslar obligat parazitlar bo’lib, faqat tirik hujayralardagina ko’paya olishi mumkin.

Viruslar keltirib chiqaruvchi yuqumli kasalliklar diognostikasida zamonoviy usullar bilan bir qatorda sinalgan turli xil viruslogik tekshirish usullari qo’llaniladi:

- elektron mikroskapiya usuli;

- sitoskapik, immunoflyuorissent usullar;

- hujayra kulturalarida viruslarni o’stirish va ajratib olish;

- rivojlanayotgan tovuq embirionida viruslarni o’stirish va ajratib olish;

- gemagglyutinasiya reaksiyasi yordamida viruslarni aniqlash;

- serologik reaksiyalar, an’anaviy serologik reaksiyalar (KBR,PR, NR) bilan bir qatorda zamonoviy (IFA, RIU, immunbloting) usullar;

- molekulyar-genetik tekshirish usullari- molekulyar gibridizasiya (MG) va polimeraza zanjirli reaksiya (PZR).

Asosan viruslarni laboratoriya sharoitida ajratib olishda quyidagi usullardan foydalaniladi: sezgir laboratoriya hayvonlarga yuqtirish, rivojlanuvchi tovuq embrionida va hujayra kulturasida o’stirish.

Viruslarni undirib olishda hujayra kulturalari muhim ahamiyatga egadir.

Hujayra kulturasi- sun’iy sharoitda o’sish va ko’payish qobiliyatiga ega bo’lgan, odam va hayvonlarning to’qima hujayralaridir.

Hujayra kulturalarini olish, qo’llashda 4 ta muhim bo’lgan muommalarni hal qilishga to’g’ri keladi, bularga kiradi:

1. Bir-biridan chegaralanib yotgan, miqdoriy jihatdan yetarili hujayralarni olish.

2. Bu hujayralarni saqlash va ko’payishini taminlovchi oziq muhitlarni qo’llash.

3. Hujayra kulturalarida bakteriyalarning ko’payib ketmasligi uchun chora tadbirlar qo’llash.

4. Viruslarni hujayra kulturalarida ko’pyayotganligini (indikasiya) aniqlash va ularni bir-birdan (identifikasiya) saralash.

Virusologik amaliyotda qo’llaniladiga oziqli muhitlar. Hujayra kulturasini saqlash va ko’paytirishda murakkab tarkibga ega bo’lgan muhitlar qo’llaniladi. Bu muhitlar tarkibiga aminokislotalar, vitaminlar, odam yoki hayvon qon zardobi, mineral tuzlar kiradi va ularning rN buferli eritmalar stabil saqlaydi.

Hujayra kulturalari uchun tayyorlangan ko’pgina oziqli muhitlar tarkibi tuzli eritmalardan iborat. Virusologik amaliyotda turli eritmalar hujayra kulturalarni organizimdan tashqarida yashashini taminlaydi va ularni tayyorlash jarayonida to’qima va hujayralarni yuvishda qo’llaniladi va virusologik oziq muhitlarni tayyorlashda asosiy manba bo’lib hisoblanadi. Amaliyotda eng ko’p Xenks va Erl tuzli eritmalari ishladiladi (jadval 8).

Virusologik amaliyotda qo’llaniladiga oziqli muhitlar kelib chiqishiga qarab farqlanadi:

1. Tabiiy oziq muhitlar (kam qo’llaniladi);

2. Oqsil moddalarning fermentativ gidrolizatlari;

3. Sun’iy oziq muhitlar.

Tabiiy oziq muhitlar asosan tuzli eritmalar asosida tayyorlaniladi va ularga odam va hayvonlar zardobi, amniotik suyuqlik va embrional ekstrakt qo’shiladi.

Zardoblar sog’lom odam, ot, sigir, buzoq, tovuq, quyon va boshqalarning qon zardoblari ishladiladi. Zardoblar olingandan kiyin ularni hujayra kulturalariga toksik ta’sirga ega emasligi aniqlanadi va uzoq mutdat sovutkichlarda saqlanishi mumkin.

Amnion suyuqligi homilador hayvonlardan, ayollardan aseptika qoidalariga rioya qilgan holda olinadi. Amnion suyuqligi rezina tiqinli flokonlarda sovutkichlarda saqlanadi.

Embrional ekstraktlar asosan 10-12 kunlik tovuq yoki hayvonlar embrionidan tayyorlanadi. Embrion tanasi qondan tozalanib, maydalaniladi va teng hajmda biror tuzli eritma (ko’pincha Xenks) qo’shiladi 30 minut sentrifuga (3000 aylanma/min.) qilinadi. Olingan cho’kma usti suyuqligi pipetkalar yordamida ajratib olinib muzlatkichlarda saqlanadi.

Fermentativ gidrolizat saqlovchi oziq muhitlar. Ko’proq sut laktoalbuminining gidrolizati va kozein va shoxli hayvonlarni oqsil gidrolizatlari ishlatiladi. Bu gidrolizatlardan oziq muhit tayyorlashda ularga tuzli eritmalar va 2, 4 va 10% gacha zardoblar qo’shiladi.

Sun’iy muhitlar. Bular ma’lum kimyoviy moddalardan tayyorlaniladi, shuning uchun ular doimiy va aniq tarkibga ega bo’ladi. Ular tabiiy moddalarga o’xshab ballast (begona oqsillar) tutmaydi. Bu muhitlar ancha murakkab tarkibga (aminokislotalar, vitaminlar, pirimidin, uglevodlar, mineral tuzlar va bosh. moddalar) ega bo’ladi. Bularga 199, Igla muhitlari kiradi.

Hujayra kulturalari. Hujayra kulturasi odam, hayvonlar, yoki parandalar va boshqa biologik ob’ektlar to’qimasidan tayyorlanadi. Hujayra kulturasini tayyorlash quyidagi bir necha ketma-ket bosqichdan iborat:

• 
  to’qimani olish, qondan, keraksiz to’qimalardan tozalash va maydalash.
  
• 
  tripsin ta’sir ettirib, hujayralarni bir-biridan ajratish.
  
• 
  hosil bo’lgan bir jinsli hujayralar suspenziyasini yuvib, tripsindan tozalash.
  
• 
  tayyorlangan hujayra kulturalarini sanash va hujayrani ma’lum miqdordagi suspenziyasini tayyorlash.
  
• 
  hujayra kulturalarini viruslarni undirishda qo’llaniladigan mahsus shisha probirka, flokon (matraslar) larda, hujayralarning o’sishini ta’minlab beradigan oziqli muhitlar qo’shib saqlash.
  

Hujayra kulturalarini olishda va saqlashda yuqorida keltirilgan oziqli muhitlardan foydalaniladi.

Hujayra kulturalarini bakteriyalar bilan ifloslanib qolmasligi uchun, hujayra kulturalari bilan ishlashda qa’tiy aseptik qoidalarga rioya qilgan holda maxsus steril bokslarda ish olib boriladi va tekshirilayotgan materiallardagi qo’shimcha mikroflorani ko’payib ketishini oldini olish maqsadida oziqli muhitlarga antibiotiklar qo’shiladi.

Hujayra kulturalarini tayyorlash usullari bo’yicha fiksasiyalangan to’qima bo’lakchalari kulturasi, bir qavatli, suspenziyalangan va organ kulturasi tafovut qilinadi.

1) Bir qavatli hujayra kulturasi- kimyoviy neytral shisha, plastika laboratoriya idishlari yuzasiga bir qavat bo’lib ( monosloy) birikib oluvchi va ko’payuvchi hujayra kulturalaridir. Virusologiya amaliyotida eng ko’p qo’llaniladi.

2) Suspenziyali hujayra kulturasi- oziqli muhitning hamma hajmida ko’payuvchi hujayralar yig’indisi bo’lib, ular har doim aylantiruvchi magnit yordamida aralashtirib turiladi. Bunday hujayra kulturalari virusologik amaliyotda vaksina preparatlari olishda qo’llaniladi.

3) Fiksasiyalangan to’qima bo’lakchalari kulturasi- maydalangan to’qima bo’lakchalari tovuq plazmasiga solinadi. Plazmada hosil bo’lgan cho’kmaga to’qima bo’lakchalari fiksasiyalanadi. Uning ustiga antibiotiklar va Xenks eritmasi, embrion ekstraktidan tayyorlangan suyuq suspenziya qo’shiladi.1-2 kundan kiyin to’qima bo’lakchalari atrofida plazma fibrinlaridan hosil bo’lgan to’rda yangi hujayralar o’sa boshlaydi.

Fiksasiyalangan to’qima bo’lakchalari kulturasini olish va saqlash ancha murakkab jarayon bo’lganligi sababli bu usulda olingan hujayra kulturalarini bir qavatli hujayra kulturasi amaliyotda siqib chiqarmoqda.

3) Organ kulturasi – Birlamchi strukturasi o’zgarmagan ma’lum organ bo’lakchalari yoki to’qima. Chegaralangan xolda qo’llaniladi.

Hujayra kulturasi va ularni undirib olish jarayonida bir qancha o’nlab generasiyalar (bir ko’payish sikli) kuzatiladi. Hujayra kulturalarining hayot faoliyati saqlanib qoluvchi generasiya sonlariga qarab bo’linadi: birlamchi hujayra kulturalari, undiriladigan va yarim undiriladigan.

Birlamchi hujayra kulturalari – to’qimalardan ajratib olingandan kiyin ko’payish generasiyasi 5-10 marotiba qayta undirib olishga yaraydi. Bunday hujayra kulturalari laboratoriya sharoitida embrional, normal to’qimalarini bo’lakchalaridan maxsus proteolitik fermentlar ( tripsin) ta’sir etirilib hujayra kulturalari olinadi.Birlamchi tripsinlangan hujayra kulturalarni kamchiligi asosan ularni bir necha generasiyadan kiyin ko’payishini to’xtab qolishi hisoblanadi.

Undiriladigan yoki stabil hujayra kulturalari – bunday hujayra kulturalari laboratoriya sharoitida bir necha 10 yillar ko’payish xususiyatini yo’qotmaydi va ko’plab qayta undirishlarga chidaydi. Bu hujayra kulturalari yuqori ko’payish potensialiga ega bo’lgan o’sma yoki embrional to’qimalardan olinadi Bularga xavfli o’sma hujayralari HeLa (birinchi marta bachadon bo’ynidagi karsinomadan), Ner-3 (limfoid karsinomasidan), hamda odam amnionining normal hujayralari, maymun buyragi va boshqalardan tayyorlapgan hujayralar kiradi va ular birlamchi hujayra kulturalariga nisbatan qator avfzalliklarga ega. Bularga kiradi: uzoq yillar undirilishi va yuqori ko’payish potensialiga ega bo’lishi, kam mexnat talabi, uzoq yillar muzlatib qo’yilganda ham o’zining xususiyatini yo’qotmasligi, xalqaro hujayra kultura liniyasi bo’ylab ko’plab dunyodagi laboratoriyalarda qo’llanilishi. Lekin, bu hujayralarning ko’plab generasiyalari natijasida havfli ko’payish xarakteri va somatik mutasiyalarga uchrash extimolligi bu hujayralarni virus vaksinalari olish jarayonlarida qo’llashni chegaralab qo’yishga olib kelgan.

Yarim undiriladigan (diploid) hujayra kulturalari – ko’paytirilib undirilishi chegaralangan 40 va 50 generasiyaga chidaydi. Bu hujayralar asosan odam embrioni diploid hujayralaridan olinadi. Undirilish jarayonida bu hujayralar o’zlarini birlamchi avlodlari singari tarkibida diploid xromosoma to’plami saqlashodi va havfli hujayra formasiga transformasiyalanmaydi. Shuning uchun bu hujayra kulturalaridan virusologik amaliyotda diognostik va vaksinalar olish maqsadlarida keng qo’llaniladi.

Viruslarni indikasiya qilish usullari. Virusologik amaliyotga hujayra kulturalarining kirib kelishi , oldin noma’lum bo’lgan ko’plab kasallik qo’zg’atuvchi viruslarni ajratib olish va ularni identifikasiya qilish imkoniyatlarini ochib berdi. Hozirgi kunda har bir viruslar uchun sezgir hujayra kulturalarini tanlash imkoniyatlari movjud.

Hujayra kulturalariga virus saqluvchi materialni yuqtirilganda, virusning ko’payishi (reproduksiyasi) natijasida hujayralarda turli o’zgarishlar ( destruksiya) kiritmalar hosil bo’lishi kuzatiladi. Viruslarning bunday xususiyati SPT (sito patologik ta’siri) ya’ni hujayrani morfologiyasini o’zgarishi, hatto uning o’limiga sabab bo’luvchi faktor deb qaraladi. Ularni quyidagi fenomenlar asosida aniqlash (indikasiya) mumkin:

1. Virusni hujayraga sitopatologik ta’siri (effekti)

2. Virusni hujayrada kiritmalar hosil qilishi

3. Pilakchalar (blyashek) hujayra kulturasida hosil qilishi

4. Gemadsorbsiya reaksiyasi

5. Gemagglyutinasiya reaksiyasi

6. Rangli reaksiya

7. Interferensiya fenomeni

Virusni hujayraga sitopatologik ta’siri (effekti). Viruslarning hujayra kulturasida ko’payayotganligi (reproduksiyasi), ularning hujayraga SPT asosida mikroskop ostida ko’rish bilan aniqlanadi va morfologik o’zgarishlarning sodir bo’lganligiga qarab baholanadi. Bunda ularning bir qismi halok bo’lib, probirka devoridan ko’chadi. Ayrim hujayralarning yemirilishi oqibatida ajralib chiqqan viruslar boshqa hujayralarga yuqadi. Ma’lum vaqtdan so’ng bu hujayralar ham o’ladi. Natijada bir qavatli yaxlit hujayra qatlami o’rnida alohida-alohida xujayrasiz zonada hujayra orolchalari hosil bo’ladi. Turli viruslar hosil qilgan (SPT) ning xarakteri bir xil emas. Bir xil viruslar (poliviruslar, Koksaki va bosh.) mayda donodor bir xil tipdagi hujayra destruksiyasini keltirib chiqaradi (rasm 33), o’choqli mayda donodor destruksiyani (gripp, kana ensefaliti) viruslari, katta donador bir xil ko’rinishdagi destruksiyani (gerpes) viruslar, simplast ko’p yadroli hujayralarni ( retroviruslar, morbiloviruslar, respirator-sinsitial) viruslar keltirib chiqaradi. Viruslarning SPT amaliyotda viruslarning birlamchi indikasiya qilishda va oldindan taxminiy tashxis qo’yishda qo’llaniladi.

Virusni hujayrada kiritmalar hosil qilishi. Ko’pchilik viruslar hujayralarda ko’payganda hujayrada ilgari kuzatilmagan kiritmalar hosil qilishlari mumkin. Masalan qutirish virusi nerv hujayralarning sitoplazmasida eozinofilli kiritmalar xosil qiladi (Babesh-Negre tanachasi), virus nukleokapsidlarini sitoplazmada (yadro oldida) yig’ilib qolishi natijasida kuzatiladi. Chin chechak virusi xujayin hujayrasining sitoplazmasida ko’payadi va sitoplazmada katta hujayralar va ularning sitoplazmasida Gvarnieri tanachalarini hosil qiladi. Yorug’lik mikroskopida ham aniqlash mumkin (rasm-34).

Pilakchalar (blyashek) hujayra kulturasida hosil qilishi.

Viruslarning miqdori jihatdan aniq sonini hisobga olish usuli hisoblanadi (34-rasm). Viruslarni ajratib olishda bir qavatli hujayra kulturasidagi oziqli muhit olib tashlanib virus saqlovchi material saqlovchi material bilan hujayra kulturasiga virus yuqtiriladi, so’ngra neytral qizil indikator qo’shilgan yupqa agar qatlami bilan qoplanadi..

Termostatda bir necha kun saqlab turilgandan so’ng, agar qoplamasida ma’lum shakldagi oq-oq dog’lar monoqatlam fonida (pilakcha) paydo bo’ladi. Bu esa, bir tekisda o’sgan hujayra kulturasi tarkibida virus ko’payishi natijasida hosil bo’lgan jonsizlangan hujayralar to’plamidir. Har bir pilakcha birgina virus zarrachasining ko’payishi natijasida hosil bo’lib, neytral qizil bilan bo’yalgan hujayralar fonida yumaloq oq dog’lar shaklida ko’rinadi.

Shu usul bilan aniqlangan virusning titri 1 ml tekshirilayotgan materialda pilakcha hosil qiluvchi birlik (PXB) bilan belgilanadi. Pilakchaning katta-kichikligi, morfologiyasi va uning paydo bo’lish vaqti, virusning har xil turida turlicha bo’ladi, xatto shu turning ichidagi ayrim shtammlarida ham farqlanadi. Viruslarning bu xususiyati shtammlarni seleksiya qilishda va ularning sof liniyasini ajratib olishda qo’llaniladi.

Gemadsorbsiya reaksiyasi. Viruslarni indikasiya qilish usullaridan biri, ular kirib ko’payayotgan (reproduksiya) hujayraning yuzasi eritrositlarni adsorbsiya qilish qobiliyatiga asoslangan, bu esa gemadsorbsiya reaksiyasi deyiladi (34 -rasm). Gemadsorbsiya ham gemagglyutinasiya reaksiyasiga o’xshash mexanizimga ega. Gemadsorbsiyalash xossasiga ega bo’lishi virus yuqtirgan hujayra membranasida virusga xos maxsus oqsillarning –gemagglyutininlarning joylashganiga bog’liq bo’lib, eritrositlarda bu oqsillarga komplementar reseptorlar bo’ladi va shuning uchun ham ular virus bilan zararlangan hujayralar yuzasiga adsorbsiyalanadi. Bu reaksiyani qo’yish uchun viruslar bilan zararlangan hujayra kulturasira eritrositlar (ko’proq tovuq, dengiz cho’chqachasi, maymun va odamning O (I) eritrositlari ishlatiladi) suspenziyasi qo’shiladi. Ma’lum vaqtdan so’ng hujayralar natriy xloridning izotonik eritmasi bilan yuviladi. Tarkibpda viruslar bo’lgan hujayralar yuzasida eritrositlar yopishganicha qoladi. Yorug’lik mikroskopida ko’rish mumkin. Virus yuqtirilgan hujayra kulturasiga tip maxsusligini na’mayon qilovchi zardob qo’shilib saqlansa, hujayralar gemadsorbsiya qilish qobilyatini yo’qotadi, ya’ni gemadsorbsiya tormozlanib qoladi. Bu fenomen viruslarning identifikasiyasida qo’llaniladi.

Viruslarni undirib olishda tovuq embrionidan foydalanish (rasm 36). Virusologik amaliyotda tovuq embrioni hujayra kulturasi va tajriba qilinayotgan hayvonlarga nisbatan bakteriyalar bilan ifloslanish darajasi kam va qo’shimcha mikroorganizmlar bilan kamdan-kam hollardagina zararlangan bo’ladi. Bundan tashqari, turli ta’sirotlarga ham juda

chidamlidir. Rikketsiya, xlamidiya va bir qator viruslarning diagnostik maqsadlarda, sof kulturasini olish va turli preparatlar (vaksina, diagnostikumlarni) tayyorlash uchun 8—12 kunlik tovuq embrionlaridan foydalaniladi. Yuqorida ko’rsatilgan mikroorganizmlarning ko’payganligi embrion qobiqlarining ochilganidan so’ng pardalarida hosil bo’lgan morfologik o’zgarishlar orqali o’rganiladi.Masalan chin chechak yuqtirigan embrion tanasida, qobig’ida qon quyilishlar kuzatiladi, embrion nobud bo’ladi. Bundan tashqari virus ko’payishi natijasida allantois, amnion suyuqligida viruslar yig’ilib qoladi va gemagglyutinin fermenti bor viruslarni GAR orqali indikasiya qilish mumkin.

Rivojlanayotgan tovuq embrionida viruslarni ko’paytirish sanoat miqiyosida qo’llaniladi, ammo ko’pchilik viruslar tovuq embrionida ko’paymaydi, bundan tashqari tekshirilayotgan viruslarni embrionini ochmay turib aniqlab bo’lmaydi, shuningdek unda ko’p miqdordagi oqsil va boshqa yod birikmalarning borligi, tayyorlangan preparatlarni allergik xususiyatini oshiradi, ularni tozalanishini qiyinlashtiradi.

Viruslarni ko’paytirishda laboratoriya hayvonlaridan foydalanish. Amalda ko’pincha turli xil zotsiz laboratoriya hayvonlaridan (voyaga yetgan, emadigon sichqon bolalari, quyon, maymun, dengiz cho’chqachalari va bosh) foydalaniladi. Hayvonlarning ma’lum turdagi viruslarga beriluvchanligi va ularning yoshi viruslarning ko’payish qobiliyati tajribada xisobga olinadi. Ko’pincha yangi tug’ilgan hayvonlargina u yoki bu virusga (masalan, emadigan sichqon bolalari — Koksaki virusiga, sichqon, quyon- qutirish virusiga, oqsim (yashur) virusi- dengiz cho’chqachasi va gripp virusi–sichqon va og’maxon) sezgir bo’ladi.

Bu usulning afzalliklari va kamchiliklari mavjud. Afzalligi shuki, bunda kultura yoki tovuq embrionida yaxshi reproduksiya qilinmaydigan viruslarni ajratib olish mumkin bo’ladi. Bu usulning kamchiligi esa, tajriba qilinayotgan hayvon organizmidagi mikroorganizmlarning begona virus va mikoplazmalar bilan aralashib ketishidadir.Bundan tashqari ekonomik etikaviy jihatlari, shuningdek, virusning “sof” liniyasini olish uchun keyinchalik hujayra kulturasiga hayvondan olingan material yuqtiriladi, bu esa tekshirish muddatini cho’zib yuboradi.

Virus saqlovchi materiallarni laboratoriya hayvonlarga yuqtirishni turli (teri ostiga, teri ichiga. muskul ichiga, qorin pardasiga, subdural va bosh.) usullari qo’llaniladi.

Viruslarning laboratoriya hayvonlar organizimida reproduksiya bo’lganligini kasallikni ko’zga tashlanadigon klinik rivojlanishi, organ va to’qimalarning patomorfologik o’zgarishi, organlardan olingan suspenziyalarda virus borligini gemagglyutinasiya (GAR), neytralizasiya (NR) reaksiyalari orqali (agar virus o’z tarkibida gemagglyutinin fermenti tutsa) aniqlash mumkin.

Metodik ko’rsatmalar

Viruslarni morozov usulida bo’yash.

Viruslarni Morozov usuli bilan bo’yash uchun uchta reaktiv tayyorlanadi:

1) 1 ml muzli sirka kislotasiga 40% li 2 ml formalin eritmasi qo’shiladi va distirlangan suv bilan uning hajmi 100 ml ga yetkaziladi;

2) 1 ml karbol kislotasiga 5 g tanin qo’shiladi va distirlangan suv bilan uning hajmi 100 ml ga yetkaziladi;

3) 5 ml kumush nitrati eritmasiga ammiak eritmasi biroz quyqa hosil bo’lgunga qadar tomchilab tomiziladi.

Bo’yash usuli: 1) tayyorlangan surtma — 1-eritma bilan 1 min davomida fiksasiyalanadi, so’ng reaktiv to’kiladi va surtma suv bilan yuviladi;

2) u 2-eritma bilan 1—2 min davomida to bug’ paydo bo’lguncha qizdiriladi, so’ngra suv bilan yuviladi;

3) 3-eritma .bilan surtma to’q jigar rang hosil bo’lgunga qadar qizdiriladi, so’ng suv bilan yuvib, quritiladi va mikroskop ostida ko’riladi. Bunda virus elementar tanachalari qora rangga bo’yaladi.Morozov usulida bo’yalganda ospa vaksina virusni o’lchami 0.2 mkm bo’lib kokksimon ko’rinishda bo’ladi. Viruslarning SPT ni o’rganish. Probirkadagi hujayra kulturasini tekshirish uchun mikroskopning buyum stolchasiga probirka shunday qo’yiladiki, undagi bir qavatli hujayra qatlami yuqoriga qaragan holda bo’lishi kerak. Bir qavatli hujayra yopishgan joyi probirkaning qarama-qarshi tomonidan qalam bilan belgilab qo’yiladi.

Materialni yuqtirishdan oldin tuxumning havoli kamera ustidagi po’stlog’i 70º li spirt bilan tozalanadi, alangada qizdiriladi, 2% li yod eritmasi surtiladi, ikkinchi marta spirt bilan artiladi va qizdiriladi.

Allantois bo’shlig’iga yuqtirish uchun havoli kamera ( ovoskopda tuxumga yorug’lik tushirilganda uning chegarasi oldindan kalam bilan chizib qo’yiladi) ustidagi tuxum po’chog’i qaychi, skalpel yoki maxsus asbob yordamida extiyotlik bilan teshiladi. Shpris bilan 0,1—0,2 ml virusli material ( antibiotik qo’shilib ishlov berilgan) havo kamerasi chegarasidan 2 — 3 mm chuqurlikka yuboriladi. Tuxum po’chog’idagi teshikka eritilgan parafin quyiladi.

Zararlangan embrion virus juda ko’paygan vaqtda, ya’ni 48—72 soat 37 ºC da termostatda saqlangandan so’ng ochiladi. Tuxum spirt bilan artiladi va unga 2% li yod eritmasi surtiladi. So’ngra qaychi bilan havo kamera atrofi bo’ylab chizilgan belgidan biroz yuqoriroqdan tuxum po’chog’i kesiladi. Bunda tuxum po’chog’i bo’shliqqa tushmasligi uchun, qiyshaytirilgan holda ushlanadi (37-rasm). Po’choq olinib, asta-sekin uning pardasi ham olinadi va xorion-allantois pardasining virus yuqtirilgan joyida gemorragik, oqimtir shikastlanish o’choqlarining bor-yo’qligi qayd qilinadi. So’ngra paster pipetkasi bilan xorion-allantois pardasining qon tomiri kam bo’lgan joyidan teshiladi va allantois suyuqligi so’rib olinadi. Keyin xorion-allantois pardasi ajratib olinib, ikki marta natriy xloridning izotonik eritmasi bilan yuviladi, Petri kosachasiga o’rnatiladi va qora fonda, maxsus (spesifik) zararlanish borligi aniqlanadi.

Gemagglyutinasiya reaksiyasini qo’yish (GAR). Tovuq embrioni ochilgandan so’ng allantois suyuqligi so’rib olinadi va probirkalarga yoki pleksiglasdan tayyorlangan plastinkalar chuqurchasiga 0,5 ml hajmda (kontrol uchun 0,5 ml yuqtirilmagan embrionning shunday suyuqligidan) quyiladi. So’ngra uning ustiga 0,2 ml 1 % li yuvilgan tovuq eritrositidan qo’shiladi va uy temperaturasida saqlanadi. Reaksiya natijasi 40 min. dan so’ng, ya’ni eritrositlar cho’kma hosil qilgandan keyin tekshiriladi. Reaksiya musbat bo’lsa probirkaning ostida bir –biri bilan yopishgan eritrositlardan tashkil topgan yupqa parda zontik xosil bo’ladi. Reaksiya natijalari 4 tagacha musbat belgi bilan aniqlanadi. Yaxshi gemagglyutnasiya + + + + — bu holatda probirkaning ostida parda zontik yaqol ko’rinishida bo’ladi; + + + pardaning oralarida ochiq joylar koladi; + + eritrositlarning birlashishida viruslar kamayganligi sababli parda chetlari tekislashadi; + kam agglyutinasiyalangan eritrositlar birikmalari bilan o’ralgan eritrositlarniig cho’kmasi; — eritrositlar cho’kmasining atrof chegarasi yaqqol ko’rinib turadi, ammo kontroldan (eritrositlar tugmacha formasini oladi) farq qilmaydi- Agar tajribadagi probirkalarda gemagglyutinasiya bo’lib, kontrol probirkalarda bo’lmasa, bu — tekshirilayotgan suyuqlikda virus borligini ko’rsatadi.

Viruslarni indikasiya qilishda tekshirilayotgan suyuqliklarda viruslarning titrini ( miqdoriy ko’rsatkichini) aniqlash muhim amaliy ahamiyatga ega. Virus saqlovchi materialni maksimal suyultirilganda virus o’zining (SPT. GAR, xayvonlarni nobud qilish va bosh.) infeksion aktivligini na’moyon qila oladigan miqdoriga virus titri deb ataladi. Titr 1 birlik qilib olingan, ya’niy shu titrda viruslar 50% yuqtirilgan kulturalarda SPT keltirib chiqaradi. GAR virus tirtri deb ++ ( I AE – bitta agglyutinasiya beruvchi birlik) dan kam bo’lmagan eritrasitlarni agglyutinasiyasini beruvchi eng ko’p suyultirilgan eritmasiga aytiladi. Viruslarni titrlarini aniqlash , viruslarning ishchi, yuqish dozalari ishlab chiqishda va keyinchalik viruslarni

Bakteriofaglar ( “bakteriya va yunoncha so’z phagos yeb yuboruvchi) –bakteriya hujayralariga maxsus kirishi va ularda parazitlik qilib, lizisga, o’limga olib keluvchi bakteriya viruslari xisoblanadi.

Bakteriofaglar atrof-muhitda, suv havzalarida, tuproqda keng tarqalgan.Shu bilan birgalikda ularni ko’pchiligi bakteriyalardan va boshqa mikroorganizmlardan va zamburug’lardan topilgan.Shuning uchun bakteriofaglar keng ma’noda umumiy so’z bilan fag deb nomlanadi. Faglarni nomlashda lotin, yunon va rus alfaviti hariflaridan, sifrlardan foydalaniladi va ularning oldida bakteriya avlodi va turi yoziladi ( E. coli T2 ). Qarindosh avlod va tur vakillarini nomlashda, ularning ajratib olingan manbasi nomi beriladi: kolifaglar, stafilofaglar, aktinofaglar va bosh.

Faglarni asosan elektron mikroskopda ularning ultrastrukturasi o’rganiladi (rasm 38). Faglar shakli va struktura tuzilishi jihatdan bir nechta morfologik tiplarga bo’linadi: ipsimon; mayda kubsimon

(ba’zilarida o’simtalar analogi bo’lishi mumkin); spermatozoidsimon faglar, ya’niy kubsimon boshi va dum qismidan iborat bo’lib, ustida qisqaruvchi va qisqarmaydigan yopqichlar mavjud bo’ladi. Faglarni o’lcham 20 dan 800 nm gacha bo’ladi.

Faglar o’zlarini tarkibida DNK yoki RNK tutadi. Faglarni nuklein kislotalari ikki ipli, bir ipli, chiziqli halqasimon bo’lishi mumkin. Ko’pchilik faglar ikki ipli halqasimon DNK tutadi. Struktura tuzilishlari viruslarga o’xshash kapsid va kapsomerlar faglar shakillanishida qatnashadi, lekin faglarda simmetriya tiplari aralash bo’ladi. Bosh qismi kubsimon simmetriyaga ega bo’lsa dum qismida spirallsimon simmetriya tiplari uchraydi.

Faglarni antigen xususiyati. Bakteriofaglar gruppospesifik va tipospesifik antigenlar tutadi va ular immunogen xususiyatga ega, organizmda maxsus antitelalar hosil qiladi.Bu antitelalar faglar bilan birikib ularni bakteriyaga qarshi litik xususiyatini neytrallashi mumkin.Tipospesifik xususiyati bo’yicha faglar serotiplarga bo’linadi.

Rezistentligi (chidamliligi). Viruslarga qaraganda tashqiy muhit faktorlariga ancha chidamli. Temperatura tasirida 65-70ºS o’ladi,bundan tashqari UF nurlari va radiasiyaning yuqori dozalari, kislota, farmolinlarga chidamli.Uzoq vaqt past temperaturada, quritganda saqlanib qoladi.

Faglarning yuqumliligi o’ta maxsus bo’lib, ma’lum bakteriyalarda ko’payadi. Ularni maxsus strukturasiga nisbatan sezgir bakteriyalarda reseptorlar mavjud.Faglarni sezgir bakteriyalar bilan maxsus o’zaro munosabatiga asosan faglar quyidagi ko’rinishlarda bo’ladi: polivalent – qarindosh bakteriyalarda ko’payya oladi; monovalent- ma’lum tur bakteriyalarda ko’payadi; tipovoy – bakteriya turlarining aloxida tiplarida ko’paya oladi.

Faglarni bakteriya bilan o’zaro munosabati viruslarga o’xshab produktiv, abortiv va integrativ ko’rinishda kuzatiladi. Produktiv formada fag bakteriyani to’liq lizisga uchratadi va fagning avlodlari hosil bo’ladi. Abortiv formada, bakteriya lizisga uchramaydi va fagning avlodlari ham hosil bo’lmaydi. Integrativ tipda esa fag bakteriyaning xromosomasiga kirib oladi va u bilan birga (profag) turadi. Shuning uchun faglarni bakteriyalar bilan o’zaro munosabati natijasida ular ikki xil ko’rinishda, virulent va avirulent (mo’’tadil) bo’ladi.

Virulent faglarni bakteriyalar bilan o’zaro munosabati produktiv tipda kuzatiladi. Ularning reproduksiyasida 200-300 ta yangi faglar xosil bo’ladi.

Mo’’tadil faglar virulent faglardan farqlanib ularning bakteriyalar bilan munosabati produktiv yoki integrativ bo’lishi mumkin (rasm -39). Produktiv ko’rinishda virulent fagdan reproduksiyasida farq kuzatilmaydi va bakteriyaning lizisi bilan tugaydi. Integrativ tipda fag genomi bakteriyaxromosomasiga kirib oladi va sinxron ko’rinishda ko’payayotgan bakteriya genomi bilan birga replikasiya bo’ladi, bakteriyani lizisga uchratmaydi. Shunday DNK saqlovchi faglar p r o f a g deb ataladi, bakteriya esa “l i z o g ye n” li kultura deb nomlanadi, chunki bunday lizogenli bakteriyalarda har doim profag aktivlansa lizisga uchrash ehtimoli yuqori bo’ladi.. Bunday bakteriyalar profagni o’z avlodlariga o’tkazadi. Lekin, fag replikasiyaga uchramaydi va o’z naslini qoldirmaydi. Buning sababi bakteriya hujayrasida fagni transkripsiyasini to’xtatib turuvchi past molekulyar oqsil repressor ishlab chiqiladi. Repressorlar biosentizini fag genlari boshqaradi. Shuning uchun bunday lizogenli bakteriyalarda boshqa faglarga nisbatan immunitet xosil bo’ladi, ya’niy boshqa yaqin qarindosh faglar bakteriyaga kira olmaydi.Ammo, lizogen termini shu bakteriyalarni har doim lizisga uchrashi mumkinligini bildiradi. Buning isboti sifatida, bakteriyalar tarkibidagi fag o’z-o’zidan spantan ravishda, yoki fizik, kimyoviy faktorlar ta’sirida vegitativ formaga o’tishi va bakteriya hujayrasini lizisga uchratishi mumkin. Bakteriya xromosomasidan ajrab chiqgan fag, bakteriyadan ma’lum ma’lum informasiya saqluvchi genlarni o’ziga biriktirib olishi va bu ma’lumotlarni boshqa bakteriyalarga (transduksiya xodisasi) o’tkazishi mumkin. Bakteriyalar oldin o’zlarida kuzatilmagan belgi va xususiyatlarni na’moyon qilishi mumkin. Profag ta’sirida bakteriyalarni xususiyatlarini o’zgarishi “ fagli konversiya” deb nomlangan ( lot. sonver-sio- o’zgartirmoq).

Bakteriofaglar amaliyotda quyidagi maqsadlarda qo’llaniladi; fagoterapiyada, fagoprofilaktikada, fagoidentifikasiyada va fagotiplashda.Bundan tashqari ichak tayoqchasini kolifagi tashqi muhit ob’ektlarini ifloslanishini aniqlashda sanitar ko’rsatkich (indikator) mikroorganizm sifatida qo’llaniladi:

1) fagoterapiya — ayrim yuqumli kasalliklarni keltirib chiqaradigan (shigella, protey, stafilokokk, ko’k yiring tayoqchasi) bakteriyalarga qarshi davolashda ishlatiladi.

2) fagoprofilaktikada — epidemik o’chokda bo’lgan kishilar orasida ayrim kasalliklarning oldini olishda (masalan, dizenteriya, vabo);

3) fagoidentifikasiyada — fag yordamida bakteriya kulturasini qaysi turga mansubligini aniqlash;

4) fagodiagnostika kasal organizmidan (masalan, najasdan) fagni ajratib olishdan iborat bo’lib, organizmda shu fagning mikrobi borligini ko’rsatadi, ya’ni fag bilan diagnoz qo’yish;

5) fagotiplash - bakteriyalarni fagotipini aniqlashda, ya’ni fagotipning, bir turdagi bakteriya shtammini shu tipga xos faglar bilan lizis qilish orqali aniqlanadi; bu esa tekshirilayotgan kulturalarni belgilaganda, kasallikni epidemiologik tekshirishda ayniqsa muhimdir.

Amaliyotda bulonda o’stirilgan bakteriyalar hujayralaridagi virulent faglar reproduksiyasi bu hujayralarning lizisga uchrashi va muhitning tiniq, yaltiroq tusga aylanishi bilan tugaydi. Petri kosachasidagi agarli muhitda sezuvchan bakteriyani gazon usuli bilan o’stirilganda faglar lizis o’choqli yoki yaxlit zonalarini hosil qiladi. Bu esa, fagning kopsentrasiyasiga bog’liqdir. Lizisning o’choqli zonalari fagning negativ koloniyalari yoki steril dog’lar — pilakchalar deb nomlanadi. Ular ma’lum faglarga xos morfologiyaga ega bo’lib, birgina fag zarrachasidan hosil bo’ladi va boshqa hujayralarga kirishi va keyinchalik ko’payishi natijasida hosil bo’ladi.

Fagning «sof liniyasini» (boshqa faglar aralashmasidan holi) olish uchun morfologik jihatdan bir xil bo’lgan negativ koloniyalarning qator passajlari bir xil bakterial shtamm gazonining aynan o’zida olib boriladi.