Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

OBSAH

OBSAH 1

zkratky 5

1 Úvod 6

1.1 Bakterie mléčného kvašení 6

1.1.1 Bakterie mléčného kvašení v lidském organismu 7

1.1.1.1 Probiotika 8

1.1.1.2 Účinnost probiotik v prevenci a léčbě nemocí 8

1.1.2 Rizika spojována s probiotickou léčbou 9

1.1.2.1 Probiotické sepse 10

1.1.2.2 Rizikové faktory probiotických sepsí 10

1.1.2.3 Mikrobiální rezistence vůči antibiotikům 10

1.2 Rod Lactobacillus 11

1.2.1 Taxonomie 11

1.2.2 Fenotypické vlastnosti 12

1.2.3 Genotypické vlastnosti 14

2. Identifikace bakterií rodu Lactobacillus 15

2.1.1 Fenotypové metody 16

2.1.2 Genotypové metody 16

2.1.2.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) 18

3. Magnetické nosiče a možnosti jejich využití k izolaci DNA pro PCR diagnostiku 19

3.1.1 Charakteristika nosičů s magnetickými vlastnostmi 20

2 CÍL PRÁCE 22

3 MATERIÁL A METODY 23

3.1 Použité mikroorganismy 23

3.2 Chemikálie 23

3.3 Kultivační média a roztoky 25

3.4 Přístroje a pomůcky 28

3.5 Metody 29

3.5.1 Kultivace bakteriálních buněk 29

3.5.2 Barvení preparátů podle Grama, mikroskopie 30

3.5.3 Izolace bakteriální DNA pomocí fenolové extrakce 30

3.5.3.1 Lyze buněk 30

3.5.3.2 Fenolová extrakce 31

3.5.3.3 Přesrážení DNA ethanolem 31

3.5.4 Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA (pomocí spektrofotometru DMS-100S) 32

3.5.5 Agarózová gelová elektroforéza 32

3.5.5.1 Příprava agarózového gelu 33

3.5.5.2 Nanášení vzorků na gel 33

3.5.6 Rodově specifická PCR 33

3.5.7 Izolace DNA z hrubých lyzátů  buněk Lactobacillus paracasei s využitím magnetických nosičů pokrytých COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl a 8% PEG 35

3.5.7.1 Příprava hrubých lyzátů buněk 35

3.5.7.2 Magnetická separace 35

3.5.8 Selektivní separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem (dle Holmberga a kol. 2005) 36

3.5.8.1 Příprava biotinylovaných PCR produktů 36

3.5.8.2 Přečištění biotinylovaných PCR produktů metodou reverzní imobilizace DNA na pevnou fázi 36

3.5.8.3 Přečištění biotinylovaných PCR produktů pomocí fenolové extrakce 37

3.5.8.4 Přečištění biotinylovaných PCR produktů pomocí PCR purifikačního kitu QIAquick 37

3.5.8.5 Izolace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem 38

4 výsledky 40

4.1 Kultivace a mikroskopická charakteristika bakteriálních buněk 40

4.2 Izolace bakteriální DNA pomocí fenolové extrakce 41

4.3 Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA 42

4.4 Rodově specifická PCR 43

4.5 Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk Lactobacillus paracasei s využitím magnetických nosičů pokrytých COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl

a 8% PEG 46

4.5.1 Izolace DNA pomocí magnetických nosičů s různým pořadím přidávání komponent do separační směsi 46

4.5.1.1 Shrnutí výsledků izolace DNA pomocí magnetických nosičů s různým pořadím přidávání komponent do separační směsi 55

4.5.2 Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA eluované z magnetických nosičů 56

4.5.3 Testování amplifikovatelnosti DNA eluované z magnetických nosičů 58

4.6 Selektivní separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem 64

4.6.1 Příprava biotinylovaných PCR produktů 64

4.6.2 Izolace nepřečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů PGMA-NH2-STV 65

4.6.3 Izolace nepřečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů MPG Streptavidin 67

4.6.4 Přečišťování biotinylovaných PCR produktů 68

4.6.5 Izolace přečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů PGMA-NH2-STV 70

4.6.6 Izolace přečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů MPG Streptavidin 71

5 diskuze 73

5.1 Kultivace a mikroskopie buněk 73

5.2 Izolace DNA metodou fenolové extrakce 73

5.3 Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk Lactobacillus paracasei s využitím magnetických nosičů pokrytých COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl

a 8 % PEG 74

5.4 Selektivní separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem 75

6 závěr 77

7 seznam literatury 78

8 publikace výsledků 83

zkratky

BMK bakterie mléčného kvašení

BMKB bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie

SDS-PAGE polyakrylamidová gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným

PCR polymerázová řetězová reakce

RFLP polymorfizmus délky restrikčních fragmentů

AFLP polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů

RAPD náhodná amplifikace polymorfní DNA

Rep-PCR interrepetitivní PCR

PFGE pulzní gelová elektroforéza

1Úvod

0. Bakterie mléčného kvašení

Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku kyseliny mléčné. Jsou to především grampozitivní, aerotolerantní nebo anaerobní bakterie, nesporulující a acidotolerantní (Klaenhammer a kol. 2005). V současné době jsou do skupiny bakterií mléčného kvašení řazeny rody Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella (Stiles a Holzapfel 1997). Rod Bifidobacterium patřící do vývojové větve aktinomycet je řazen mezi BMK díky fenotypické podobnosti (Stiles a Holzapfel 1997).

Biochemicky se do BMK zařazují jak homofermentativní, tak heterofermentativní druhy. Homofermentativní BMK (např. Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus
a některé laktobacily) produkují primárně kyselinu mléčnou, zatímco heterofermentativní (např. Leuconostoc, Weissella a některé laktobacily) produkují ekvimolární množství kyseliny mléčné, oxidu uhličitého a etanolu (Obrázek 1). BMK jsou mezofilní organismy, které ale mohu růst i při teplotách nižších než 5 °C a vyšších než 45 °C. Stejně tak většina druhů roste při pH 4,0 – 4,5, ale některé při pH 9,6 a jiné při pH 3,2 (Caplice
a Fitzgerald 1999).
Ačkoli jsou BMK primárně využívány pro rychlou produkci kysaných potravinových výrobků, podílejí se také na vzniku příchutí, konzistence a nutriční hodnoty výrobků. BMK se přirozeně vyskytují v různých prostředích, a proto může fermentace probíhat v mléku, masu, zelenině, cereáliích a rostlinách. Historicky byly
a jsou BMK využívány jako startovací kultury při výrobě potravin, zvláště fermentovaných mléčných výrobků, ve kterých jsou přítomny ve vysokém množství (Klaenhammer a kol. 2005, Vaughan a kol. 2005). Nicméně mikrobiální analýza těchto mléčných výrobků prokázala, že množství a zastoupení bakteriálních druhů ne vždy odpovídá informaci uvedené na etiketě produktů (Temmerman a kol. 2003b, Coeuret
a kol. 2004).


Obrázek 1: Obecné schéma fermentace glukózy u BMK (upraveno dle Caplice a Fitzgerald 1999).

1. Bakterie mléčného kvašení v lidském organismu

V roce 1908, Ilja Mečnikov, tehdy působící v Pasterově ústavu, předpokládal, že mléčné bakterie ve fermentovaném mléku podporují rozvoj zdravé střevní mikrobioty. Tento laureát Nobelovy ceny vypracoval teorii, podle které mléčné bakterie v zažívacím traktu mohou preventivním rozkladem látek prodloužit život jedince. Poté

se zjistilo, že některé BMK a gram-pozitivní bifidobakterie (v této práci souhrnně označované BMKB) se přirozeně vyskytují v lidských nebo živočišných tělních dutinách, včetně gastrointestinálního traktu (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis), ústní dutiny (Streptococcus mutans, Bifidobacterium longum)
a vaginální dutiny (Bifidobacterium longum, Streptococcus agalactiae, Lactobacillus crispatus). Z celkové střevní mikrobioty kojených dětí BMK zaujímají méně než 1 %, zatímco bifidobakterie tvoří 60 – 90 %. Bifidobakterie obvykle osidlují střevní trakt kojenců hned po narození a během prvního týdne se stávají dominantní bakteriální skupinou. Množství a druhové zastoupení BMKB osidlujících gastrointestinální trakt novorozence jsou závislé na tom, zda je kojen, nebo dostává sušené mléko (Salminen
a kol. 2005). V lidském střevě je přítomno  10^12-13 bakterií na gram obsahu tlustého střeva a odhaduje se, že je zde přes tisíc bakteriálních druhů (Klaenhammer a Kullen 1999, Vaughan a kol. 2005).

1. Probiotika

BMKB jsou dnes považovány za důležité složky normální střevní mikrobioty, které jsou nezbytné pro různé funkce organismu hostitele, včetně střevní integrity

a odolnosti vůči patogenům. Vybrané druhy rodů Lactobacillus a Bifidobacterium jsou široce užívány jako tzv. probiotika, která jsou obsažena především v mléčných výrobcích a potravinových doplňcích (Klaenhammer a kol. 2005). Jako probiotika se někdy užívají
i bakterie, které normálně neosídlují intestinální trakt. Patří sem např. druhy rodů Lactococcus, Leuconostoc a Pediococcus (Moreira a kol. 2005).

Probiotika (Tabulka 1) jsou nejnověji definována jako „živé mikroorganismy, které podávány v přiměřeném množství jsou prospěšné pro zdraví hostitele“ (Klaenhammer a kol. 2005). Aktuální bezpečnostní kritéria probiotik jsou taková, že kmeny pro lidské užívání musí být izolovány ze zdravého lidského gastrointestinálního traktu, musí být nepatogenní, nesmí se vyskytovat ve spojení s nějakým onemocněním

a nemají přenášet geny kódující rezistenci na antibiotika (D`Aimmo a kol. 2007). U řady probiotik bylo zjištěno, že jsou užitečné pro udržení zdraví gastrointestinálního
a urogenitálního traktu (Zhong 1998). Na blahodárné působení mikroorganismů na lidský organismus poprvé poukázal Döderlein, který zjistil, že kyselina octová produkována vaginálními bakteriemi zabraňuje nebo inhibuje růst patogenních bakterií (Holzapfel
a kol. 2001).

2. Účinnost probiotik v prevenci a léčbě nemocí

Při studiu průběhu průjmových onemocnění, které provází zvýšená mukózní permeabilita střev, bylo prokázáno, že probiotické druhy bakterií rodu Lactobacillus tuto permeabilitu střeva snižují. Tyto kmeny rovněž produkují bakteriociny, peroxid vodíku

a biosurfuktanty, které jim umožňují přežívat v gastrointestinálním traktu a mnoho z nich kompetitivně inhibuje adherenci patogenních bakterií na střevní epitel. Řada probiotických kmenů indukuje in vitro produkci mucinu střevním epitelem, jiné druhy zase stimulují produkci antimikrobiálního peptidu, defensinu-2. Důležitým mechanismem zabránění účinku patogenních bakterií je i skutečnost, že samy probiotické druhy adherují na střevní epitel. Tato přechodná kolonizace může být dostatečnou ochranou proti patogenním mikrobům, může podporovat funkci mukózní vrstvy a dále stimulovat lokální a systémové imunitní reakce (Boyle a kol. 2006, Vaughan a kol. 1999, Holzapfel a kol. 2001) – pravděpodobně aktivací makrofágů, změnou exprese cytokinů, zvýšením aktivity přirozených buněčných zabíječů a/nebo vzrůstem hladiny immunoglobulinů (Isolauri a kol. 2001). Nicméně, mechanismy, pomocí nichž tyto probiotické kmeny fungují jako immunomodulátory, nejsou dostatečně prostudovány (Klaenhammer a kol. 2005).
Tabulka 1: Mikrobiální druhy řazené mezi probiotika (upraveno dle Holzapfel a kol. 2001).




Rod Lactobacillus Rod Bifidobacterium Další BMK Druhy nepatřící do BMK

L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis¹ Bacillus cereus var. toyoi^1,2

L. amylovorus B. animalis Enterococcus faecium Escherichia coli

L. casei subsp. animalis Lactococcus lactis³ Propionibacterium freudenreichii^1,2

L. crispatus subsp. lactis Leuconostoc mesenteroides Saccharomyces cerevisiae²

L. delbrueckii B. breve Pediococcus acidilactici³ Saccharomyces boulardii²

subsp. bulgaricus B. bifidum Sporolactobacillus inulinus¹

L. gallinarum¹ B. infantis Streptococcus thermophilus³

L. gasseri B. longum

L. johnsonii

L. paracasei

L. plantarum

L. reuteri

L. rhamnosus

¹ Hlavně aplikované na živočichy.

² Významné hlavně jako farmaceutické přípravky.

³ Druhy s málo prostudovanými probiotickými vlastnostmi.

2. Rizika spojována s probiotickou léčbou

Ačkoli většina komerčně dostupných probiotických bakterií je považována

za zcela bezpečné organismy a mají status GRAS (generally recognized as safe) (Klaenhammer a kol. 2005), existují jisté obavy o možnostech infekce, pokud jde
o vysoce rizikové populace. Jedná se především o jedince infikované HIV, kojence
a předčasně narozené děti (Boyle a kol. 2006).

1. Probiotické sepse

Druhy rodu Lactobacillus byly vzácně identifikovány jako příčina endokarditid

u dospělých lidí (u dětí byly popsány jiné formy sepsí), kteří neužívali probiotika. Existuje několik zpráv o bakteriálních sepsích dávaných do souvislosti s užíváním probiotických potravinových doplňků. Mezi těmito patogenními a probiotickými kmeny nebyly nalezeny pomocí pulzní gelové elektroforézy žádné rozdíly v restrikčních fragmentech chromozomální DNA. Někdy ovšem byly ve střevní mikrobiotě zdravých jedinců nalezeny jak probiotické tak patogenní kmeny. Z tohoto důvodu nebyl zdroj infekce vždy potvrzen (Boyle a kol. 2006).

2. Rizikové faktory probiotických sepsí

Všechny případy bakteriémií způsobených probiotickými bakteriemi postihly pacienty se základním imunitním deficitem, chronickým onemocněním nebo jiným oslabením. Žádná zpráva nepopisuje sepsi spojenou s užíváním probiotik zdravými osobami. Většina příznaků probiotických sepsí ustoupila po vhodné antimikrobiální terapii, ale v některých případech se u pacientů vyvinul septický šok nebo byl výsledek sepse fatální. Nicméně tato úmrtí byla s větší pravděpodobností způsobena vlastním onemocněním než probiotickou sepsí (Boyle a kol. 2006).

V posledních letech rovněž stoupá četnost onemocnění vyvolaných probiotickými houbami. Probiotický druh Saccharomyces boulardii je užíván pro prevenci a léčbu akutních a chronických průjmových onemocnění. Ačkoli je tento druh považován
za bioterapeutické agens, jsou známy případy infekce způsobené tímto probiotickým zástupcem (Hennequin a kol. 2000).

3. Mikrobiální rezistence vůči antibiotikům

Probiotika většinou kolonizují lidské střevo přechodně. Přesto existují obavy možného přenosu genů kódujících antimikrobiální rezistenci z probiotických kmenů

na patogenní bakterie střevní mikrobioty, zvláště enterokoky a Staphylococcus aureus (Boyle a kol. 2006). Některé druhy Lactobacillus jsou přirozeně rezistentní
na vankomycin, jedno z antibiotik podávaných při onemocnění multirezistentními patogeny. Geny kódující tuto rezistenci jsou chromozomální, proto jejich přenos není tak snadný (Salminen a kol. 1998, Boyle a kol. 2006). Ačkoli antibiotická rezistence kódována plazmidy není u laktobacilů obvyklá, může se vyskytnout. U takových kmenů musí být zvážena jejich bezpečnost. Jakmile se zjistí, že může dojít k přenosu genů kódujících rezistenci na antibiotikum mezi fylogeneticky odlišnými bakteriemi, kmeny nesoucí tyto geny pro rezistenci by neměly být využívány ani jako lidská ani jako zvířecí probiotika (Saarela a kol. 2000).

2.