Dərs vəSAİTİ baki 013 ~ ~
Yüklə 2,8 Kb. Pdf görüntüsü
|
~ 90 ~ buferi əlavə edərək bir saat saxlayırlar. pH 8 olan 0,1M fosfat buferi hazırlamaq üçün 95 ml 0,2M Na 2 HPO 4 ·2H 2 O məhlulu götürülərək üzərinə 5 ml 0,2 NaH 2 PO 4 ·H 2 O məhlulu əlavə olunur və həcmi 200 ml-ə çatdırılır. Homogenat miqdarı 100 ml-lik konusvari kolbaya keçirilir və həcmi fosfat buferi ilə 50 ml-ə çatdırılır. Kolbadakı məhlul 1 saat müddətində rotoforda qarışdırılır. Sonra kolba götürülür və işçi məhlulun çökməsi üçün 15 dəqiqə sakit qoyulur. Sonra pipetkanın köməyilə homogenatın üst hissəsindən ehtiyatla 10 ml məhlul gö- türülərək sentrifuqa sınaq şüşəsinə keçirilir. Məhlul 15 dəqiqə otaq temperaturunda sentrufuqada 3000 dövr/dəq sürətlə hərəkət etdirilir. Sentrifuqa edildikdən sonra sınaq şüşəsindən 1 ml çöküntü üzərindəki məhluldan götürülərək başqa sınaq şüşəsinə keçirilir. Üzərinə 9 ml pH 8 olan fosfat buferi əlavə olunaraq möhkəm qarışdırılır, ondan sonra zülalların cəmi məhlulu spektrofotometrləmə üçün hazır olur. 2. Zülalların cəminin təyin edilməsinin spektrofotometrik me- todu. Zülal məhlulu kvars küvetə tökülür və onun 280-260 nm-də optik sıxlığı (müqayisə üçün başlanğıc fosfat buferindən istifadə olunur) təyin edilir. Zülalların tərkibindəki areometrik amin tur- şular – tirozin və triptofan işığı λ-280 nm sahəsində udur. Lakin bu sahədə udmaya nuklein turşuları da malikdir, sonuncunun maksiumum uduculuğu λ-260 nm dalğa uzunluğu təşkil edir. Ona görə də məhlulda zülalların qatılığını təyin etmək üçün, qeyd olu- nan metodla – Varburq-Xristian bərabərliyindən istifadə olunur: C=1,55·D 280 -0,76·D 260 Burada: C - zülallın miqadrı, mq/l; D 280 -D 260 - məhlulların 280 və 260 nm dalğa uzunlu- ğunda optik sıxlığı, nm; 1,55 və 0,76 - hesabat əmsalları. Toxumun nümunə çəkisində zülalların cəmi miqdarı (mq/q quru kütləyə görə) formulla hesablanır: ~ 91 ~ , burada C – Varburq-Xristian formuluna görə tapılmış məhlulda zülalın miqdarı; V – işçi məhlulun miqdarı, ml; m – nümunə çəkisinin kütləsi, qramla; 10 – işçi məhlulun duruldulmasını nəzərdə tutan əmsal; 86 – toxum nümunəsinin hava quru kütləsinin quru kütləsi, %; 60 - cücərmiş toxumların quru kütləsi, %. Nəticələr cədvəl 2.7-də əks etdirilir. Cədvəl 2.7 Bitki Numunənin kütləsi, q İşçi məhlulun həcmi, ml Optik sıxlıq Nümunədə zülalların qatılığı, mq/ml Bitkidə zülalın qatılığı, mq/q D 280 D 260 Alınan nəticələrə müqayisəli təhlil verilir. 3. Bitkinin vegetativ orqanlarından zülalların ayrılması. 0,5 q təzə bitki materialı çəkilir (arpa yarpağı, kartof yumruları) xırdalanır və farfor həvəngdə 4 qat (kütləyə görə) pH 8 olan fosfat buferi, 0,2%-li natrium busulfid və bir neçə damla etil spirti ilə əzilir. Homogenat 10 ml soyuq 5% ÜXS əlavə olunur, möhkəm qarışdırılır və 20 dəqiqə soyuducuda saxlanır. Sonra homogenat sentrifuqa sınaq şüşəsinə keçirilir və 15 dəqiqə 6000 dövr/dəq dövr etdirilir ki, zülallar çöksün. Sentrifuqadan sonra çöküntü üzərindəki məhlul axıdılır. Çöküntü soyudulmuş 96%-li etanolla çöküntü üzərindəki məhlulun yaşıl rəngi tam itənədək yuyulur. Sentrifuqa edilmə təkrar olunur və yuyulmuş çöküntüyə 2 ml 0,5 N NaOH əlavə olunur. Sınaq şüşəsi 5 dəq qaynayan su hama- mında yerləşdirilir, sonra əlavə olaraq 5 ml 0,5N NaOH tökülərək qarışdırılır və 10 dəqiqə 6000 dövr/dəqiqə dövr etdirilməklə sentrifuqadakı çöküntü üzərindəki maye ölçülü silindrə keçirilir və qələvi hidrozatın ümumi həcmi ölçülür. Nümunədə zülalın ~ 92 ~ miqdarı Louri metodu ilə təyin edilir. 4. Louri metodu ilə zülalların təyini. Bu metodla zülalların miqdarını təyin etmək üçün əvvəlcədən məhlullar hazırlanmalıdır: A - 2% Na 2 CO 3 - 0,1 N NaOH-da; B – 0,5% CuSO 4 ·5H 2 O – 1% K-Na şərab turşusunda; C – A və B məhlullarının qarışığı (50:1 həcmə görə); E – Folin reaktivi. 1 ml qələvi hidrolizat götürülür, 5 ml C məhlulu əlavə olunur, qarışdırılır və 10 dəqiqədən sonra 0,5 ml E məhlulu əlavə olunur. Qarışıq 30 dəqiqə müddətində otaq temepraturunda saxlanır, sonra 750 nm dalğa uzunluğunda optik sıxlıq ölçülür. Müqayisə məhlulu kimi qarışıqdan istifadə edilir: 1 ml 0,5N NaOH, 5 ml C məhlulu və 0,5 ml Folin reaktivi. Məhlulda zülalın miqdarını təyin etmək üçün albumin yaxud kazeinə görə qurulmuş kalibrləmə qrafiki qurmaq lazımdır. Analitik tərəzidə 100 mq albumin çəkilir və 100 ml-lik fosfat buferində həll edilir. Həmin standart məhluldan zülalın miqdarı 0,05-1,0 mq/ml olan işçi məhlul hazırlanır. Bu isə 2.8 saylı cəd- vələ uyğun aparılır. Ardıcıl şəkildə hər albumin məhlulundan 1 ml götürülür, əv- vəlcədən nömrələnmiş sınaq şüşələrinə əlavə olunur, təcrübi nü- munələrində olduğu kimi 5 ml C məhlulu, 10 dəqiqədən sonra 0,5 ml E məhlulu əlavə olunur. Hər bir sınaq şüşəsindəki kütlə ehti- yatla qarışdırılır və otaq temperaturunda 30 dəqiqə saxlanır. Qeyd olunan vaxtdan sonra məhlulun λ-750 n/m dalğa uzunluğunda optik sıxlığı ölçülür. Cədvəl 2.8 № Zülalın miqdarı, mq/ml Albumin standart məhlulu, ml Fosfat buferi, ml Optik sıxlıq, D 750 1 0,05 0,5 9,5 2 0,1 1,0 9,0 3 0,2 2,0 8,0 4 0,3 3,0 7,0 5 0,4 4,0 6,0 6 0,5 5,0 5,0 7 1,0 10 0 Yüklə 2,8 Kb. Dostları ilə paylaş:
|