Sevda dulger tez

 

56 

KH

2

PO

4

  tampon  çözeltisi,  pH=3,6)  ile  analizlere  başlandı.  Maddelere  ait  pikler 

görülmedi.  Ancak  yapılan  metot  geliştirme  çalışmaları  sırasında  validasyonunun 

verimi  göz  önüne  alınarak  taşıyıcı  faz,  pH’sı  ve  karışım  oranı  değiştirilmiştir 

[Sadeghipour ve ark, 1996].  %10Asetonitril:%90fosfat tampon çözeltisi için 100 ml 

asetonitril  ile  900  ml  fosfat  tampon  çözeltisi  1000  ml’lik  beherde  önce  manyetik 

karıştırıcı  ile  karıştırılmış  ve  taşıyıcı  fazın  pH’sı  0,1  M’lık  ortofosforik  asitle  oda 

sıcaklığında 4,2’ye ayarlanmıştır. Çözelti vakum pompası yardımıyla mikro filtreden 

geçirilmiştir.  Filtre  edilen  çözelti  ultrasonik  banyoda  15  dakika  bekletilerek  degaze 

işlemi  yapılmış,  sonrasında  yeniden  pH  ayarı  yapılarak  +4°C’de  stoklanmıştır.  Her 

kullanım  öncesi  taşıyıcı  fazın  oda  sıcaklığına  ulaşması  beklenmiş,  pH’sı  gözden 

geçirilerek  degaze  işlemi  tekrarlanmıştır.  Pompa  izokratik  olup  tek  yönlü  akış 

sağlamaktadır. 

 

2.3.3.2. Dalga Boyu Optimizasyonu 

Stok  standartları  metanol  içerisinde  hazırlanmış  olan  standart  MDMA  çözeltileri, 

çalışmada kullanılacak olan dalga boyunun belirlenmek amacıyla, 200, 220, 250 nm 

dalga  boyu  aralığında  cihaza  enjekte  edilmiştir.  200  nm  dalga  boyunda 

kromatogramlarda piklerin düzgün çıktığı görülmüştür. 

 

2.3.3.3. Kolon Optimizasyonu  

Aynı dolgu materyalli C18 kolon 250 mm ve 150 mm olmak üzere iki farklı kolonda 

çalışılarak aynı derişimde elde edilen pik alanları incelendi. Çalışmada her iki kolon 

için 3’er enjeksiyon yapıldı. 150 mm uzunluğunda 4 µm çap ve 3,9 mm kalınlığında, 

dolgu  materyali  silika  bazlı  C18  NovaPak  Waters  marka  kolon  kullanılmıştır. 

Küresel yapılı olan kolon dolgu materyalinin por genişliği 60 Å, yaklaşık yüzey alanı 

120 m

2

/g, yaklaşık por miktarı da 0,3 ml/g’dır.  

 

 

---

 

57 

2.3.4. Fiziksel Đnceleme 

Tabletlerin renk, logo, ağırlık, çap, kalınlık gibi fiziksel özellikleri kaydedildi. 

 

2.3.5. GC-MS Đle Analizler 

36  adet  tabletler  0,3-1,2  mg/mL  aralığında  kloroformda  çözülerek  hazırlandı. 

Enjektör  süzgeci  yardımıyla  süzüldü.  GC-MS’nde  genel  sıcaklık  programı  ile  nitel 

analizleri yapıldı.  

Standart stok MDMA ve kafein çözeltilerinin konsantrasyon doğruluğunun ve 

farklı konsantrasyonlar arasındaki ilişkiyi gözlemek amacıyla her konsantrasyon için 

3’er  enjeksiyon  yapılarak  standart  MDMA,  kafein  ve  tetrakosan  stoklarının 

doğruluğu ve kolonda kalma süreleri (Rf) belirlendi.  

Đ

ç    standartın    (tetrakosanın)    çalışmada    kullanılacak    olan    uygun  

konsantrasyonun  belirlenmesi  için  farklı  konsantrasyonlarda  enjeksiyon  denemeleri 

yapılmıştır.  

 

2.3.6. GC ile Analizler 

2.3.6.1. GC ile Nitel Analizler  

GC  cihazı  ile  nitel  analiz  yapmak  için  standart  MDMA  ve  kafein  çözeltileri  5  kez 

enjekte  edildi.  Ortalama  MDMA,  kafein  ve  alıkonma  süreleri  tespit  edilip, 

tabletlerinde analizleri yapılarak MDMA ve kafein pikleri tespit edildi.  

 

---

 

58 

2.3.6.2. GC Analiz Metodu Validasyonu 

2.3.6.2.1. Doğrusallık 

Doğrusallık için 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20 µg/mL konsantrasyon aralığında hazırlanan 

MDMA  standart  çözeltileri  3’er  kez  enjekte  edilerek,  konsantrasyona  karşılık 

ortalama  MDMA  alanları  grafiğe  geçirildi.  MDMA  kalibrasyon  eğrisi  çizildi  ve 

korelasyon katsayısı hesaplandı. 

Aynı analizler kafein için tekrarlandı. Kafein için konsantrasyon aralığı 1, 6, 

8,  10,  14,  16  µg/mL  aralığındadır.  Kafein  alanları  ve  standart  kafein 

konsantrasyonları  kullanılarak  kalibrasyon  eğrisi  çizilmiş  ve  korelasyon  katsayısı 

hesaplandı. 

Tabletlerin  stok  tetrakosan  (iç  standart)  kullanılarak  0,5mg/mL  derişimli 

çözeltileri  hazırlandı.  GC  analizleri  yapıldı  ve  tabletlerdeki  MDMA  ve  kafein 

miktarları hesaplandı. 

 

2.3.6.2.2. Tekrarlanabilirlik 

Metot  ve  cihaz  tekrarlanabilirliği  gün  içi  analizler  için  incelendi.  Gün  içi  metot 

tekrarlanabilirliği  için,  µg/mL  konsantrasyon  aralığında  hazırlanan  MDMA  standart 

çözeltileri aynı gün içinde 3’er kez enjekte edilerek ortalamaları, standart sapmaları, 

CV ve % RSD’leri hesaplandı.  

 

2.3.6.2.3. Geri Kazanabilirlik  

MDMA için yapılan enjeksiyon işlemlerinin verimini hesaplamak için 10 adet tablet 

seçilerek her bir tablet için 3 ayrı tartımla hazırlanan 3 numune ve her bir numunenin 

3 kez enjekte edildi. Bu uygulama arasında elde edilen veri farkından yararlanılarak 

% verimi hesaplandı.  

 

---

 

59 

2.3.6.2.4. Hassasiyet 

Ön  çalışmalardan  elde  edilen  verilerden  faydalanarak,  çalışılacak  derişimler 

belirlenmiştir,  10  µg/ml  derişimde  6’şar  kez  enjeksiyon  yapılmıştır.  Sonuçların 

standart sapmasının 3,3 katı LOD ve 10 katı LOQ olarak hesaplanmıştır. 

 

2.3.7. HPLC ile Analizler 

2.3.7.1. HPLC ile Nitel Analizler  

HPLC  cihazı  ile  nitel  analiz  yapmak  için  standart  MDMA  çözeltisi  5  kez  enjekte 

edildi.  Ortalama  MDMA  alıkonma  süresi  tespit  edilip,  tabletlerinde  analizleri 

yapılarak  MDMA  piki  tespit  edildi.  HPLC  analizlerinde  daha  önce  yapılan  GC-MS 

ve  GC  analizlerinden  tespit  edilen  yapısal  ve  bileşim  olarak  farklılık  gösteren  10 

tablet  seçilmiş  olup,  sadece  çözme  işlemi  yapıldığından  HPLC  analizlerinde  Đç 

Standart kullanılmaya ihtiyaç duyulmamıştır. 

 

2.3.7.2. HPLC Analiz Metodu Validasyonu 

2.3.7.2.1. Doğrusallık 

Doğrusallık için 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 15; 20 µg/mL konsantrasyon aralığında hazırlanan 

MDMA standart çözeltileri 3’er kez enjekte edilerek, konsatrasyona karşılık ortalama 

MDMA alanları grafiğe geçirilerek MDMA kalibrasyon eğrisi çizilmiş ve korelasyon 

katsayısı hesaplanmıştır. 10 µg/mL olarak hazırlanan 10 tabletdeki MDMA değerleri 

belirlenmiştir. 

 

2.3.7.2.2. Tekrarlanabilirlik 

Metot ve Cihaz tekrarlanabilirliği  gün içi analizler için incelenmiştir. Gün içi metot 

tekrarlanabilirliği  için,  0,5;  1;  2,5;  5;  10;  15;  20  µg/mL  konsantrasyon  aralığında 

---