Sevda dulger tez

 

43 

1.3.6.

 

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi Cihazı (HPLC) 

 

Ş

ekil 1.11.  HPLC akış diyagramı. 

HPLC  cihazı;  çözücü  (hareketli  faz)  deposu,  pompalama  sistemi,  örnek  enjeksiyon 

sistemi,  ayırmanın  oluştuğu  kolon,  her  madde  için  farklı  sinyal  veren  dedektör  ve 

dedektör sinyallerinin kaydedildiği bir yazıcıdan oluşmaktadır.  

 

1.3.6.1. Hareketli faz sistemi  

HPLC’de  hareketli  faz  sisteminde    çözünmüş  gazlar  (genellikle  oksijen  ve  azot) 

bulunmamalıdır. Bunlar daha sonra dedektör sisteminde kabarcık oluşturarak analize 

etkimektedir. Gaz gidericiler (degasserlar) bu çözünmüş gazları uzaklaştırmaktadırlar 

(Skoog ve Leary, 1992). 

Hareketli  faz  taneciksiz  olmalıdır.  Bu  nedenle  filtreler  kullanılmaktadir. 

Ucunda  çelik  ya  da  teflon  bir  filtre  içeren  teflon  pompa  giriş  hortumu  çözücü  içine 

MOBĐL 

  FAZ 

POMPA 

ENJEKTÖR 

numune 

dedektör 

  

 

 

 

  data 

K

o

n

s

.

 

zaman 

Toplama    

   kabı 

kolon 

kromatogram 

---

 

44 

daldırılır.  Filtre,  pompaya  hava  gitmemesi  için  çalışma  boyunca  sıvının  içine 

tamamen  daldırılmış  durumda  olmalıdır.  Ayrıca  çözücü  vakum  altında  milipore 

filtreden geçirilir (Skoog ve Leary 1992). 

Ayırma, sabit bileşimli tek çözücü ile yapılıyorsa buna izokratik işletim denir. 

Ayırma  süresini  kısaltmak  için  polaritesi  farklı,  birbiri  ile  karışmayan,  eşit 

viskozitede,  sabit  fazla  etkileşmeyen  çözücülerin  analiz  süresince  bileşimleri 

oranının  basamaklı  ya  da  sürekli  değiştirilmesi  de  çözücü  programlaması  (gradient 

işletim) dır. Gaz kromatografideki sıcaklık programlamasına benzemektedir. 

Đ

ki  ya  da  daha  fazla  çözücü  deposunun  kullanıldığı  HPLC  cihazlarında 

çözücülerin  karıştırılma  oranlarını  ayarlayan  karıştırma  bölmesi  de  bulunmaktadır 

(Skoog ve Leary 1992).  

Klasik  açık-kolon  kromatografisinde  (flash  chromatografi)  faz  graviteye  bağlı 

olarak  kolonun  içinden  akarak  geçer.  Bu,  partikül  büyüklüğü  fazla  olan  stasyoner 

fazlar için (Partikül  yarıçapı 50 - 100 mikron civarı olan) iyi işleyen, ancak ayrılma 

zamanı  çok  uzun  olan  bir  uygulamadır.  Bu  süreyi  azaltmak  ve  daha  küçük 

partikülleri  olan  stasyoner  fazlarda,  mobil  fazı  kolondan  geçirmek  için  basınç 

uygulamak  gerekir.  Bu,  pompanın  görevidir.  Bu  sisteme  “solvent  dağıtıcı  sistem” 

denir. HPLC içinde mobil fazın sabit akışı, kolon malzemesine (stasyoner faz) karşı 

olan rezistansı ile sağlanır (Brown, 1989; Gibert, 1987). 

Ters  faz  (reverse  phase)  mobil  fazları  genellikle  su  temelli,  iyonik  tampon  ve 

organik çözücü karışımlarından oluşmaktadır. Ters faz kromatografisinde kullanılan 

polar  zayıf  çözücü  sudur.  Kuvvetli  çözücü  olarak  da  en  çok  metanol,  asetonitril  ve 

tetrahidrofuran kullanılır (Bakes, 2000). 

Bir HPLC sistemi yılda yaklaşık 100 – 300 l çözücü tüketir. Bu nedenle çözücü 

fiyatları da dikkate alınmalıdır (Gray, 2000).Son yıllarda metot geliştirmede su bazlı 

mobil faz tercihi veya tampon kullanımı, kolon materyaline vereceği zarar da dikkate 

alınarak tercih edilmektedir.  

 

---

 

45 

1.3.6.2. Pompalama sistemi  

HPLC’nde  yararlanılacak  pompanın  seçiminde  en  önemli  etken,  yüksek  basıncın 

sağlanmasıdır.  Pompalarda  aranan  diğer  özelikler  ise,  değişmeyen  bir  akış 

verebilmesidir. Kullanılan çözücülere karşı da dayanıklı olmalıdır.  

 

1.3.6.3. Numune enjeksiyon sistemi 

HPLC’nde  örnek  verilirken  akış  devam  etmeli,  basınç  kaldırılmamalıdır.  Örnek 

verme işlemi tekrarlanabilir olmalıdır. Đki tip enjeksiyon vardır. 

Arka 

arkaya 

çalışılacaksa 

manuel 

enjeksiyonda 

septum 

mutlaka 

değiştirilmelidir.  Septum  enjeksiyonda,  sistem  açılarak  akış  durdurulur,  madde 

kolona  verilir.  Sonra  sistem  kapanır,  çözücü  akışı  başlatılır.  Bu  kapatıp,  açma 

sırasında denge bozulur (Skoog ve Leary 1992). 

Son yıllarda enjeksiyon işlemi, otomatik (otosampler) yapılmaktadır. Enjektör 

vialden  istenilen  miktarda  örnek  çekip  bunu  direkt  lupa  girmeden  akış  hattına 

bağlanarak  sisteme  vermektedir.  Her  enjeksiyondan  önce  ve  sonra  enjektör  ucu 

yıkanabilmektedir. Bu da gelişmiş pompa sistemi sayesinde olmaktadır.  

 

1.3.6.4. Kolon sistemi  

Çözücü enjeksiyon sisteminden geçtikten sonra HPLC sisteminin ayırma birim olan 

kolona  gelir.  HPLC  kolonları  paslanmaz  çelik  ve  camdan  yapılmış  düz  kolonlardır.  

Kolonlar analitik ya da preparatif amaçlı olabilirler.  

 

Analitik kolonlar 

Analitik  yani  nicel  analiz  amaçlı  olan  kolonlardır.  Đç  çapı  4  ile  10  mm  olup 

mikropartiküler  ya da pelliküler dolgu içeren kolonlardır. Mikropartiküler dolgunun 

---

 

46 

tümü,  ayırmayı  yapacak  olan  dolgu  iken,  pelliküler  dolguda  ayırmayı  yapacak 

malzeme bir destek katısının yüzeyinde belli kalınlıkta kaplanan bir dilimi oluşturur. 

Analitik kolonlar birinci tip dolgu içerdiğinde 10-30 cm, ikinci tip dolgu içerdiğinde 

ise 50-100 cm uzunluktadır. 

En uygun çalışma mekanizmasını ve kolon tipini seçmek için maddenin yapısı 

hakkında  detaylı  bilgilere  sahip  olmak  gerekmektedir.  Madde  hakkında  çok  fazla 

bilgimiz yoksa ve maddemiz suda çözünüyorsa ilk tercih edeceğimiz mekanizma ters 

faz  kromatografisi,  iyonik  maddeler  için  iyon  çifti  veya  iyon  değiştirme 

mekanizması,  eğer  maddemizin  izomerleri  var  ise  veya  suda  çözünürlüğü  olmayıp 

polaritesi  düşük  çözücülerde  çözünüyorsa  normal  faz  tercih  edilmelidir  (Weston, 

1998). 

 

Preparatif kolonlar 

Karışım  içindeki  istenen  bileşenleri  ayırarak  elde  etmeye  yönelik  olan  preparatif 

kolonlar, genellikle 6 mm çaplı 25-100 cm uzunluğunda kolonlardır.  

 

Koruyucu kolonlar 

Bir  analitik  kolonun  ömrü,  ön  kolon  kullanmak  suretiyle  uzatılır.  Ön  kolonlar  2,1 

mm  çap  ve  10  cm  uzunlukta  olup,  pelliküler  madde  ile  doldurulmuştur.  Ön  kolon 

kullanmak analiz sırasında basınç değişikliği yapmaz. Kirli örnekle çalışıldığında ön 

kolon kullanılmazsa analitik kolonun verimi hızla azalır (Erdik ve ark., 1991) . 

 

Kolon Termostatları 

Đş

letim sırasında  genellikle kolon sıcaklığının kontrolü önemli değildir.  Fakat kolon 

sıcaklığının  sabit  tutulmasıyla  daha  iyi  kromatogram  elde  edilebilmektedir.  Bazı 

---