Microsoft Word Biotexnologiyan?n ?saslar? f?nnind?n muhazir? m?tnl?ri doc
Yüklə 5,01 Kb. Pdf görüntüsü
|
coli – dən fərqli olaraq bu bakteriyalarda çox az miqdarda nukleazalar sintez olunur və alınan ferment preparatının xeyli hissəsini DNT-plomeraza təşkil edir. Belə preparatdan çoxlu təmiz DNT-polimeraza almaq olduqca asan başa gəlir. Lakin B. subtilis və M. luteus – dən alınan DNT – polimerazalar E. coli – dən alınana nisbətən qeyri-stabillik və zəif aktivlik göstərirlər. DNT fraqmentlərinin bir-birinə tikən fermentlər DNT-liqazalar adlanır. Bu fermentlər fosfor-efir əlaqəsi şəklində olan kovalentrabitə ilə istənilən DNT fraqmentlərini in vitro şəraitdə biri-birinə və ya DNT fraqmentini vektor ilə möhkəm birləşdirirlər (tikirlər). DNT-liqazalar fraqmentləri təkcə “yapışqanlı” uclardan deyil, istənilən nahiyyədən birləşdirə bilirlər. Genetik mühəndislik zamanı çox vaxt DNT fraqmentini və ya geni vektora birləşdirərkən komplementarlığı təmin etmək üçün ondan nukleotidlərin müəyyən hissəsini parçalayıb ayırmaq tələb olunur. Bu halda nukleazalardan və ya ekzonukleaza ilə endonukleaza qarışığından ibarət ferment kompleksindən istifadə edilir. Hibridləşdirilmiş nümunələrin in vitro şəraitdə hazırlanması üçün DNT-aza- 1, metilaza-E CoR 1, α – ekzonukleaza, RNT – polimeraza fermentlərindən istifadə edilir. Onların köməkliyi ilə DNT molekulunun istənilən nahiyyəsindən nukleotidləri ayırmaq və ya birləşdirmək mümkün olur. Genetik mühəndislikdə istifadə olunan fermentlər bir qayda olaraq bakteriyalardan alınır. Genlərin alınması. Hər şeydən əvvəl genin struktur qurluşuna nəzər salaq. DNT və RNT ardıcıl yerləşən nukleotidlərdən təşkil olunmuşdur. Hər üç nukleotid müəyyən məlumat daşıyır, məsələn: Hər nukleotid üçlüyü və ya triplet müəyyən amin turşusuna uyğun gəlir. Belə triplet kodon adlanır. Amin turşularından ibarət çox böyük olmayan təkzəncirli polipeptid molekulunun (sadə zülalın) sintezində çoxlu miqdarda kodonlar iştirak edir. Bir polipeptid zəncirini sintezedən kodonlar yığımı sistron adlanır. Bir neçə polipeptid zənciri (mürəkkəb zülal) sintez etmək üçün çoxlu sayda sistronlar lazım gəlir. Belə sistronlar çoxluğuna gen deyilir. Zülal və ya başqa metobolit sintezini kodlaşdıran gen DNT zəncirinin müəyyən bir sahəsidir. Bioloji fəal maddələrin sintezini kodlaşdıran genlərin alınması genetik mühəndisliyin ilk mühüm mərhələsidir. Bu mərhələnin müvəffəqiyyətli həlli aşağıdakı şərtlərə əməl olunmasından asılıdır: 1. gen və donor genemunda onun vəziyyəti; 2. gen tərəfindən kodlaşdırılan məlumat RNT-nin ayrılma üsullarının hazırlanması; 3. gen məhsuluna görə onun aktivliyinin müəyyən edilməsi metodları; 4. gen və genemon ona yaxın olan nahiyyələrinin quruluş xüsusiyyətləri; 5. gen tərəfindən kodlaşdırılan m-RNT-nin miqdarı. Genləri üç müxtəlif üsulla alırlar: 1.kimyəvi-fermentativ sintez yolu ilə; 2.geni təbii mənbələrdən bilavasitə ayırmaqla; 3.məlumat-RNT əsasında genlər sintez etməklə. Genlərin kimyəvi-fermentativ sintezi. Əgər genin kodlaşdırdığı zülal və ya polipeptid zəncirinin ilkin quruluşu məlumdursa onu kimyəvi-fermentativ sintez yolu ilə alırlar. Zülalın ilkin qurluşunu DNT zəncirindəki nukleotidlər ardıcıllığı təmin edir. Deməli, ilkin quruluşu bilməklə zülalı kodlaşdıran gendə nukleotidlər ardıcıllığını müəyyən etmək mümkündür. Bu ardıcıllığı bildikdən sonra geni laboratoriya şəraitində sintez etmək imkan yaranır. Genin kimyəvi sintezini aparmaq üçün iki məsələnin həlli tələb olunur. Birincisi, mononukleotiddəki fosfor qrupunu kimyəvi fəallaşdırmaq üçün agentin (amilin) tapılmasıdır. Bu aktivlik hesabına fosfodiefir rabitəsi və ya nukleotidlərarası əlaqə yaranır. Adətən nukleotidlərin birləşməsini təmin edən aktivləşdirici kimi disikloheksilkarbodiimid, mezitilensulfonilxlorid və triizopropilbenzolsulfonilxloriddən istifadə edilir. kincisi, purin və pirimidin ə saslarında olan 3-hidroksil, 5-hidroksil, amin və fosfat qruplarının özlərini mühafizə edən üçün xüsusi qruplar seçmək tələb olunur. Mühafizə qrupları elə maddələrdən təşkil olunmalıdır ki, onlar nukleotidlərə zərər vurmamalı, nukleotidə çox asanlıqla birləşmək və ondan ayrılmaq xassələrinə malik olmalıdır. Sintez prosesi pilləli aparılır: əvvəlcə, di-, tri- və tetranukleotidlər alınır, sonra isə ayrı- ayrı tetranukleotid blokları liqaza fermenti vasitəsilə bir-birinə birləşdirilir. Bir zəncir sintez olunduqdan sonra ona komplementar olan ikinci zəncir də sintez edilir. Beləliklə, gen və ya iki zəncirli DNT molekulu fraqmenti alınır. Genlərin təbii mənbələrdən bilavasitə alınması. Təbii mənbələrdən bilavasitə gen almaq üçün DNT molekulu hüceyrədən ayrılır və axtarılan gen endonukleaza fermentlərinin köməyi ilə “kəsilib” götürürlər. Lakin bu üsulun bir sıra çatışmayan cəhətləri vardır. Birincisi, lazım olan geni ayırmaq üçün istənilən nahiyyədən DNT molekulunu parçalayan fermenti tapmaq çox çətin başa gəlir. Adətən ferment DNT-ni elə fraqmentlərə parçalayır ki, axtarılan gen yerləşən fraqmentdə lazımsız nukleotidlər ardıcıllığı da olur, bu da gendən istifadə olunmasına maneçilik törədir. Bəzən də ferment DNT-ni elə fraqmentlərə parçalayır ki, bir genin ayrı-ayrı hissələri müxtəlif fraqmentlərə birləşmiş olur, daha doğrusu, gen ferment tərəfindən iki yerə bölünür, nəticədə isə tam funksional gen almaq mümkün olmur. kincisi, eukariot orqanizmlərin genləri mozaik quruluşa malikdir, yəni gendə fəal (ekzon) və qeyri-fəal (intron) nahiyyələr vardır. Ekzon nahiyyələr kodlaşmada iştirak etdikləri üçün onlara fəal nahiyyələr deyilir. ntronlar isə ə ksinə, passiv olub, kodlaşmada iştirak etməyən nahiyyələrdir. ntron nahiyyələr bakteriya hüceyrəsində ayrılmadıqları üçün belə genlərin prokariot (bakteriya) hüceyrədə normal fəaliyyəti bərpa olunmur. Yüklə 5,01 Kb. Dostları ilə paylaş:
|