[54]
DNK sekvenirlash
DNK sekvenirlash.
Biopolimerlar,
nuklein kislotalarni- DNK, RNK,
oqsillarni sekvenirlash, ularning nukleotid va aminikislotali ketma-ketliklarini
aniqlash bo‗lib,
lotin tilidan
sequentum
- ketma ketlik ma‘nosini anglatadi.
Sekvenirlanish natijasida monomerlar ketma-ketliging chiziqli tuzilmasi to‗g‘risida
matn shaklida rasmiy tavsifi hosil qilinadi. DNK sekvenirlangan qismlari odatda
100 nukleotidlar juftidan oshmaydi-
next generation sequencing
va Senger
sekvenirlanishi bo‗yicha 1000 nukleotidlar jufti hosil qilinishi mumkin. Bir-birini
qoplaydigan DNK qismlari sekvenirlanishi natijasida to‗liq genlar, umumiy
i-RNK
yoki organizmlar to‗liq genomi to‗g‘risida ma‘lumot beradigan genlar qismlari
olinadi (23-rasm).
21-rasm. Radiofaol izotop bilan nishonlangan PZR mahsulotlariga ega bo‟lgan
gel qismlari. Radioavtograf. (Senger uslubida sekvenirlash)
[55]
Sekvenirlash uchun Edman, Senger va boshqa uslublar qo‗llaniladi, odatda
hozirgi
kunda
genlarni
sekvenirlash
uchun
Sengerning
ddNTP-
didezoksinukleoziduchfosfatlar uslubi qo‗llaniladi. Sekvenirlashdan oldin DNK
ning PZR-
polimerazali zanjirli reaksiya
uslubi yordamida taniladigan ketma-ketligi
amplifikasiya qilinadi. To‗liq genom sekvenirlanishi
yangi avlod sekvenirlash
tehnoligiyalarini
next generation sequencing
uslubini qo‗llab amalga oshiriladi.
22-rasm.DNK sekvenirlanish uslubi.
Didezoksinukleotid yoki ―zanjir uzilishi‖ uslubi F.Senger tomonidan 1977
yilda ishlab chiqilgan bo‗lib, hozirgi kunda DNK nukleotid ketma-ketligini
aniqlashda keng qo‗llaniladi. Senger bo‗yicha sekvenirlashda sekvenirlanayotgan
zanjirning
maxsus
17-20
nukleotid
uzunligiga
ega
bo‗lgan
sintetik
oligonukleotidning gibridizasiyasi amalga oshiriladi. Bu oligonukleotid praymer
bo‗lib, 3‘-gidroksil guruhni matritsaga komplementar bo‗lgan, zanjirning
inisiasiyasini boshlaydi. Praymerli eritmalar 4 ta probirkaga joylashtiriladi, ularning
har birida dATP, dCTP, dGTP, dTTP dezoksinukleotidlar bo‗lib, ularning biri
[56]
radioizotop bilan nishonlangan va 4 ta 2‘, 3‘-didezoksinukleotidlardan ddATP,
ddTTP, ddGTP, ddCTP biri bo‗ladi. Didezoksinukleotid
hamma pozisiyalar
bo‗yicha uzayib borayotgan zanjirga qo‗shiladi, va uning zanjirga qo‗shilish joyida
zanjir sintezi to‗xtaydi. Buning natijasida har 4 probirkada DNK-polimeraza
ishtirokida praymer ketma-ketligiga ega bo‗lgan oligonukleotidlarning har hil
uzunlikdagi noyob to‗plami hosil bo‗ladi. Keyinchalik
probirkalarga zanjirlarni
ajratish uchun formamid qo‗shiladi, va poliakrilamid gelida to‗rt hil yo‗lakchada
elektroforez o‗tkaziladi. Sekvenirlangan DNK segmentlarini ―o‗qish‖ maqsadida
radioavtografiya o‗tkaziladi. Zamonaviy uslubda didezoksinukleotidlarni to‗rt hil
turli tuman fluorescent bo‗yoqlar bilan bo‗yaladi va bitta probirkada PZR
o‗tkaziladi. So‗ngra poliakrilamidli elektroforezda lazer nuri gelning ma‘lum
qismida fluorescent bo‗yoqlarini qo‗zg‘atadi va gelda migrasiya bo‗lgan nukleotidni
detector aniqlaydi. Zamonaviy asboblar yordamida
DNK ning kapillyar
elektroforezini o‗tkazishda foydalaniladi.
Dostları ilə paylaş: