Yönetim kurulu başkan
Yüklə 6,77 Mb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- 1.DNA DİZİLEME TEKNİKLERİ 1.1.Sanger Dizileme
- 1.2.Next Generetion Sequenceing(NGS)=Yeni Nesil Dizileme
- NEXT GENERATION SEQUENCING (yENİ NESİL DİZİLEME) VE KLİNİK ONKOLOJİDE KULLANIMI
- 1.2.1. Dizileme Kütüpanelerinin Olşturulması
- 1.2.2. Dizileme Reaksiyonu Ve Belirlenmesi
- 1.2.3. Dizi Analizi Datasının Anlamlandırılması
- 1.2.4. Reference Mapping
- 1.2.7. Variant Annotaion (Varyantların Anlamlandırılması)
- DİZİ ANALİZİ METODUNUN SEÇİMİNİ ETKİLEYEN fAKTÖRLER
48 6. Türk
Tıbbi Onkoloji
Kongresi Genetik ve Moleküler Testler DNA dizileme teknolojilerindeki ilerlemeler genomik araştırmalar- da bir devrim yaratmıştır. Yaklaşık son 10 yılda bu konuda inanılmaz ilerleme kaydedilmiştir. Bugün 3 milyar baz içeren genomumuzun 24 saatte dizilenmesi mümkündür ve bunun maaliyeti ise yaklaşık 1000 dolara olarak verilmektedir (Morey et al., 2013; National Human Ge- nome Research Institute, 2013; Hayden, 2014). DNA dizileme işlemi şu anda son derece ucuz ve hızlıdır bir şekilde gerçekleştirilmektedir. Bu duruma ulaşılmasında yeni nesil dizileme (NGS) sistemlerinin rolu çok fazladır. Yeni nesil dizileme sistemleri araştırma alanında yaygın bir kullanım alanına sahiptir. Bunun yanında her geçen gün klinik pra- tikte de uygulama ve kullanım alanı artmaktadır..Bununla beraber bir çok klinisyenin eğitimleri içerisinde bu konu yer almadığından söz ko- nusu uygulamaların kliniğe getirdiği yararlar hakkında yeterli bilgiye sahip değildirler. Bu derleme,NGS’nin tıp uygulamalarındaki yerinin ve bu uygulamaların diğerlerinden farkının ne olduğunu klinisyenlere basit bir düzeyde anlatma amacını taşımaktadır. Onkolojide genomiksin anlaşılması son derece önemlidir. Genetik anomalilerin, kanser gelişiminde ve prognozundaki yerinin anlaşıl- ması tedavi protokollerininde değişmesine neden olmaktadır. Bunun dışında genetik anomalilerin belirlenmesi hastaların prognozunun anlaşılmasında, tedavide uygun ilacın kullanılmasında, hastaya uy- gun tedavinin seçiminde, riskli kişilerin ise gelecekte sahip olacakları kanser türleri için risklerinin belirlenmesinde son derece önemlidir. Örneğin BRAF gen mutasyonu metastatik kolon kanser hastalarınd a kötü prognoza işaret etmektedir (Sclafani et al., 2013). BRCA1/2 gen mutasyonları meme/over kanser rsiki taşıyan hastaları, MMR gen mutasyonları kolon kanser rsikini taşıyan kişileri belirlemekte- dir (Ford et al., 1998). Buna ilave olarak genetik değişiklikler kansere karşı yapılan ilaçların uygun olup olmadığının anlaşılması amacı ile de kullanılmaktadırlar. Örneğin BRAf mutat melanomlu hastalar içn Ve- murafenib, ALK translokasyonu taşıyan akciğer kanserli hastalar için Crizotinib, Wild Tip-RAS geni taşıyan kolorektal kanserli hastalar için Panitumumab isimli hedefe yönelik ilaçlar kullanılmaktadır (Chap- man et al., 2011; Douillard et al., 2013; Shaw et al., 2013). DNA dizileme işlemi şu an için en yaygın olarak bilimsel amaçlı kul- lanılmakta ve birçok farklı kanser türünde büyük kohortları kapsayan çalışmalarda tüm genom ve eksom dizileme yapılmakatdır. Ulusla- rarası ortak birçok çalışma yürütülmektedir. Bunlardan biri Kanser Genom Atlası (Cancer Genome Atlas (TCGA)), International Cancer Genom Consorsium‘un yaptığı çalışmalardır. Bu çalışmalarda kanser ile ilişkili genomik bozukluklar tanımlanmaya çalışılmaktadır (Bian- kin et al., 2012;Cancer Genome Atlas Network, 2012; Dulak et al., 2013; Parsonset al., 2008). Bunula birlikte birçok klinisyen genomiks hakkında sınırı bilgiye ve eğitime sahip olduğu için dizi analizi teknolojilerinden ve bunların kullanım alanları konusunda detaylı bilgilere sahip değildirler. Bu ko- nuşmanın amacı klinisyenler bu konuda fikir ile pratikteki uygulama alanları hakkında bilgi vermektedir.
te ilk olarak DNA’nın PCR işlemi ile çoğaltılması gerekmektir. Daha sonra kimyasal olarak di-deoksinukleotid haline getirilen değiştiril- miş floresan nukleotidler kullanılarak ikinci bir PCR işlemi yapılmakta ve farklı boyutlarda oluşan DNA parçaları gel üzerinde büyüklüklerine göre dizilmekte ve ortaya çıkan nükleotid dizisi referans DNA dizisi ile karşılaştırılarak farklılıklar belirlenmektedir (Lander et al., 2001; Sanger et al., 1977a,b). Bu dizileme işleminde en fazla 600-800 bp bölgeler tek reaksiyonda incelenebilir. DNA’nın her iki yönde incelen- mesi için de en az 2 reaksiyon yapılması gerekir. 1.2.Next Generetion Sequenceing(NGS)=Yeni Nesil Dizileme: Yeni nesil dizileme, çıktısı yüksek olan çok sayıda hastanın ve bir re- aksiyonda çok sayıda gen bölgesinin dizilendiği bir DNA, RNA dizile- me işlemidir. Bu dizleme işlemine aynı zamanda Massively–Parallel Sequencing (MPS) de denmektedir. Sanger dizi analizi ile yeni nesil dizleme sistemi arasında en önemli fark NGS’de milyonlarca DNA fragmenti aynı anda dizilenebilmektedir. Bu nedenle çıktısı son dere- ce yüksek bir yöntemdir. Şu an bilinen yeni nesil dizi analizi sistemleri NEXT GENERATION SEQUENCING (yENİ NESİL DİZİLEME) VE KLİNİK ONKOLOJİDE KULLANIMI Prof. Dr. hülya yaZıcı istanBUl ünivErsitEsi, onkoloji Enstitüsü, kansEr GEnEtiği BiliM dalı
49 6. Türk
Tıbbi Onkoloji
Kongresi Genetik ve Moleküler Testler 2. Nesil dizileme sistemleridir. Önümüzdeki yıllarda 3. Nesil dizi ana- lizi sistemleri gündeme gelecektir. Bu sistemlerde çok daha az DNA kullanılarak işlem yapılabilecektir. Yeni nesil dizileme sistemleri ara- sından çok farklı dizileme yapan cihazlar olduğu gibi farklı başlangıç noktası ile işlem yapma yetenekleri de bulunmaktadır. Rutin uygulamalar içn üretilen KİT lerde genellikle PCR metoduna da- yalı yeni nesil dizileme metodları kullanılmaktadır. Bunun yanında di- rekt DNA’dan da dizileme yapan farklı KIT’ler bulunmaktadır. Yeni ne- sil dizileme sistemleri her ne kadar kendi içlerinde farklılık gösterse de genel olarak bu dizileme sistemlerinde yapılan işlemler aşağıdaki sıra ile gereçekleştirilmektedir. 1.2.1. Dizileme Kütüpanelerinin Olşturulması: Bu aşamada 2 me- tod vardır. Bunlardan biri Amplicon temelli dizilemedir ki bu metotta belli gen bölgeleri dizilenir. Bu yöntem PCR’a dayalı bir yöntemdir. Di- ğer yöntemde ise DNA molekülü parçalara ayrştırılır ve herbir parça çoğaltılır ve bunun üzerinden dizileme yapılır. İkinci metotta DNA’nın her noktası dizilenebilir ya da burada da hibridizasyon işlemine spesi- fik hale getirerek istenilen gen bölgesi de dizilenebilir.
nılan PCR teknolojileri farklı NGS sistemlerinde farklı şekilde oluştu- rulmaktadır. Roche ve ABI’da emilsüyon PCR (emPCR) kullanılırken Illumina teknolojisinde Bridge –PCR kullanılmaktadır (Dressman et al., 2003). Hem em-PCR hem de Bridge PCR ile milyonlarca kopya aynı anda farklı örnek ve farklı genler için çoğaltılır. Bu işlem sırasında kullanılan DNA polimeraz enzimi %100 doğrulukla çalışmaz ve belli bir oranda enzimden kaynaklanan hatalı sonuç oluşmaktadır (Mardis, 2011). Bu nedenle patolojik olarak çıkan her sonucun her iki yönden Sanger dizi analizi ile muhakkak doğrulanarak kontrol edilmesi ge- rekir. Her bir NGS cihazı Hücre ya da Flow-Cell adını verdiğimiz DNA par- çalarının immobilize edildiği bir kısım içermektedir. DNA parçaları bu noktalara immobilize edildikten sonra yıkama işlemine tabi tutulur- lar. Bu aşamadan sonra dizileme işlemine geçilir. İmmobilize edilmiş DNA parçaları üzerinde tekrar bir nükleotid karşılığı bulunması ile di- zileme işlemi gerçekleştirilir. İmmobilize Cell’in üzerindeki DNA’daki diziye göre ilave edilen he bir nukleotidin çıkardığı floresan, iyon ya da hidrojen kameralar ya da özel bir PH metre vasıtası ile ölçülür.
analiz edilebilmesi için günlük kullandığımız bilgisayarlardan biraz daha özellikli bilgisayarlara ihtiyaç vardır. Oluşan dizi bilgisi her bir nukleotid için doğrulanır ve doğrulama skorlarını geçmiş fragmentler analiz edilir. Bu işlem “Quality Score” yani “Kalite Kontrol“ olarak ad- landırılır. Belli bir kalite skorunu geçen diziler ileri analiz aşaması için değerlendirilir. Bu aşama NGS işleminde en önemli aşamadır. Kalite skoru bundan sonraki işlemler için son derece önemli bir kriterdir. Bu skoru geçemeyen hiçbir dizi değerlendirmeye ve Variant Calling ve Variant Annotation aşamalarına alınmaz. 1.2.4. Reference Mapping: Bu aşamada dizisi yapılan DNA’lar ilgili genlerin dizisi ile karşılaştırılır. Bunun için kullanılan çok sayıda nite- likli bilgisayar ve bilgisyar programı mevcuttur.
rans dizi ile karşılaştırıldıktan sonra ne gibi farklılıkların olduğunun saptanması işlemidir. Bu işlem içinde kullanılan birçok bilgisayar programı bulunmaktadır. Ilumina cihazında bu işlem Illumina Vari- ant Studio programı ile yapılırken Ion Torrent NGS cihazında Torrent Variant Caller denilen bir bilgisayar programı ile yapılmaktadır. Bu aşamada en fazla zorluk tümör dokusu ile çalışılan örneklerin analizi sırasında yaşanmaktadır. Dizi analizi çalışması tümör dokusundan ya- pılmış ise tümör dokusunun heterojenliği sebebi ile farklı değişiklikler farklı oranlarda görülür. Bunun değerlendirilmesi son derece güçtür. Şayet klinisyen için sadece tümörde oluşan variantların saptanılması önemli ise elde edilen tüm veriler yaralı iken sadece ilaç direnci için bir veriye ihtiyaç duyuluyorsa ve bu veride varolmasına rağmen istenilen düzeyde değilse değerlendirilmesi zorluk yaratmaktadır.. 1.2.7. Variant Annotaion (Varyantların Anlamlandırılması) : Bu aşama, saptanan değişikliklerin fonksiyonlarının ne olduğunun saptanması aşamasıdır. Bu aşamada da kullanılan birçok bilgisayar programı olmakla beraber, bu aşama gerçek bir kanıtı da içinde barın- dırmalıdır. En çok kullanılan programlar arasında Polyphen2, Mutati- on Taster, Sift, Oncotator, SnpEff or Alamut sayılabilir. Her ne kadar bilgisayar programları ile söz konusu değişikliğin genin fonksiyonuna nasıl bir etki yaptığı tahmin edilse de bunun deneysel olarak kanıt- lanması en doğru sonuçtur. Bunun için her bir sonuçun geleneksel metodlarla kesinlikle doğrulanması gerekir. Bu doğruma metodu de- ğişikliğin bulunduğu yere göre bazen sacede Sanger ile tekrarlanma şeklinde olabileceği gibi bazen ise mRNA üzerinden incelenme ve di- zilenme işlemini gerektirebilir. NGS dizileme metodunda okuduğunuz değerin kaç kere okunduğu- nun ve okunan değerlerin birbirlerine oranları son derece önemlidir. Ortalama olarak bir bazın en az 30 defa okunması beklenmektedir. Ancak bazı gen bölgelerinde özellikle G, T, A, C tekrarlarının çok ol- duğu bölgelerde hatalı okumalar gerçekleşmekte ve bu sayıya ula- şılamamaktadır. Böyle durumlarda bu bölgelerdeki değişikliklerin kesinlikle altın standart olarak değerlendirilen Sanger dizi analizi ile doğrulanması gerekmektedir. Bu durumlarda variantları belirleyen bilgisayar programlarının hassasiyetinin ve spesifikliğinin yüksek ol- masınında önemi oartaya çıkmaktadır (Ajayet al., 2011; Koboldt et al., 2010; Nielsen et al., 2011; Voelkerdinget al., 2009). DİZİ ANALİZİ METODUNUN SEÇİMİNİ ETKİLEYEN fAKTÖRLER Yeni nesil dizileme platformunda neyi nasıl ve ne için dizileyeceğimiz son derece önemlidir. Ne istediğimize bağlı olarak dizileme metodu- muz ve gen ya da genomun neresini dizileyeceğimiz değişmektedir. Şayet tüm genomu dizilemek (WGS) istiyorsak bu bilginin edinilmesi ve bu bilginin dizilmesi ve anlamlandırılması gereçekten son derece zor bir iştir. Ayrıca tüm genomu dizilediğinizde genomun yaklaşık 3 milyar baz olduğunu düşünürsek ve DNA polimeraz enziminin %0.01 Yüklə 6,77 Mb. Dostları ilə paylaş:
|