Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
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entwässert. Vor der Eindeckung mit Corbit-Balsam wurden die Schnitte drei mal 
kurz in Xylol 100% getaucht.  
2.6.1.2.2 Immunhistochemische Färbung des Zytokins TGF-ß1 
Für das Versuchsprotokoll 1, sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-
Glomerulonephritis wurde eine Färbung des Zytokins TGF-ß angefertigt. Zur 
immunhistologischen Darstellung von TGF-ß1 wurde eine modifizierte APAAP 
(Alkalische Phosphatase Anti Alkalische Phosphatase)-Färbung verwendet. 
Hierzu wurde zur Detektion des gebundenen Primärantikörpers ein mit einem 
Polymer konjugierter Sekundärantikörper benutzt, an welches das für die 
sichtbare Farbreaktion notwendige Enzym Alkalische Phosphatase mehrfach 
gekoppelt wurde. Auf diese Weise kann eine Verstärkung des Farbsignales 
erzielt werden und Antigene, die nur schwach ausgeprägt sind, deutlicher 
dargestellt werden. Vor der Färbung musste ein TBS (Tris Buffered Saline)-
Puffer hergestellt werden. Dazu wurde zunächst eine Stammlösung bestehend 
aus zwei Komponenten angesetzt: Stammlösung A: Herstellung einer 0,5 M 
Tris-Lösung, bestehend aus 60,55 g Tris-Base/ 1 l a.dem.. Stammlösung B: 
Herstellung einer 1,5 M NaCl-Lösung, bestehend aus 87,66 g NaCl/ 1 l a.dem.. 
Die Stammlösungen wurden bei 4°C aufbewahrt, vor Gebrauch im Verhältnis 
1+1+8 Teile a.dem. angesetzt und mittels 5 M HCl-Lösung auf pH 7,6 
eingestellt. Die immunhistologische TGF-ß1-Färbung wurde am Paraffinschnitt 
in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur durchgeführt. Es erfolgte 
zunächst die Entparaffinisierung, das Einbringen der Schnitte in die 
absteigende Alkoholreihe und Kochen in Zitratpuffer wie oben beschrieben. 
Dann wurden die Gewebestückchen auf den Objektträgern mit einem Fettstift 
(DAKO Pen™, DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland) umkreist und in 
TBS-Puffer eingestellt. Anschließend wurden die Schnitte für 30 min mit 
inaktiviertem fetalem Kälberserum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) (30 min 
bei 65°C) inkubiert. Es folgte eine 30 minütige Inkubation mit einem 
polyklonalen Primärantikörper Rabbit-anti-Rat-TGF-ß1 (SantaCruz, 
Biotechnology, Inc. Heidelberg, Deutschland). Der Antikörper wurde zuvor im 
Verhältnis 1:25 mit einem Antikörperverdünnungsmedium (1Teil inaktiviertes 
fetales Kälberserum, 1 Teil RPMI-Medium, 8 Teile a.dest.) verdünnt. Auf den 

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Objektträgern befanden sich drei Schnitte. Ein Schnitt diente jeweils als 
Negativ-Kontrolle und wurde anstelle des Primärantikörpers mit 
Antikörperverdünnungsmedium inkubiert. Nach der Inkubation wurde mit TBS-
Puffer gespült. Es folgte eine 30 minütige Inkubation mit dem 
Sekundärantikörper Goat-anti-Rabbit EnVision™ Alkalische Phosphatase 
(DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland). Dann wurde erneut mit TBS-
Puffer gespült und die Schnitte mit dem Substrat-Chromogen Fast Red (Fast 
Red Kit, DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland) versetzt. Das Substrat 
wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt. Die Intensität der Färbung 
wurde mikroskopisch kontrolliert. Die Färbedauer betrug 5 min bis zur 
Entwicklung eines intensiv roten Farbsignals. Die Färbung wurde durch Spülen 
mit aqua dem. gestoppt. Die Kernfärbung erfolgte in Mayers Hämatoxillin für 
eine Dauer von 10 min. Abschließend wurden die Schnitte für 10 min unter 
fließendem Leitungswasser gebläut und in einem wässrigen Eindeckmedium 
(ImmuMount™, Shandon,
 
Pittsburgh, USA) luftblasenfrei eingedeckt.  
2.6.1.3 Histologische Auswertung 
Die mikroskopischen Auswertungen wurden mit einem Lichtmikroskop in einem 
verblindeten Modus durchgeführt, wie er in anderen Arbeiten bereits publiziert 
wurde [65]. Dazu wurden jeweils 25 Glomeruli pro Schnitt untersucht. Der 
prozentuale Anteil der Bereiche des Glomerulus, die von Matrix eingenommen 
waren wurde von 0-100% bewertet. Von allen pro Schnitt bewerteten Glomeruli 
wurde anschließend der Mittelwert gebildet. Die Auswertung erfolgte durch 
einen unabhängigen Untersucher, der über die Gruppenzugehörigkeit nicht 
informiert war. 
2.6.2  ELISA – Enzym Linked Immuno Sorbent Assay 
Zum spezifischen Nachweis auch kleiner Mengen von Zytokinen und Proteinen 
kam die ELISA-Methode [68] zur Anwendung. Bei den verwendeten ELISA 
handelte es sich um kompetitive ELISA. Eine absorbierende Mikrotiterplatte 
wurde mit dem zu bestimmenden Antigen beschichtet. Alle freien 
Bindungsstellen der Mikrotiterplatte wurden zur Verhinderung von 

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unspezifischer Bindung und Absorbtion des Primärantikörpers oder des 
Antigens der Probe mit Bovinen Serum Albumin verdeckt. Bei Zugabe der 
Proben und des Primärantikörpers in die so vorbereitete Platte konkurrierte das 
Antigen der Probe mit dem Antigen, das an die Platte gebunden hat, um die 
Bindungsstellen des Primärantikörpers. Bei dem Primärantikörper handelt es 
sich um einen spezifischen monoklonalen Antikörper gegen das zu 
bestimmende Protein. Zur quantitativen Bestimmung der Menge an spezifisch 
gebundenem Primärantikörper muss der Anteil an Antikörpern, der nicht 
spezifisch oder gar nicht gebunden hat, aus der Platte entfernt werden. Dies 
geschieht durch mehrmaliges Waschen. Ein Sekundärantikörper, der polyklonal 
ist und sich gegen den Primärantikörper richtet, ermöglicht es, die spezifischen 
Bindungen zu detektieren. Der Sekundärantikörper wurde in diesem Fall mit 
einem Enzym gekoppelt. Dadurch war es möglich, die Menge des gebundenen 
Sekundärantikörpers anhand des Substratumsatzes zu ermitteln. Unspezifisch 
oder ungebundene Sekundärantikörper wurden wieder durch Waschen entfernt. 
Der Umsatz an Substrat ist durch eine Farbentwicklung erkennbar, die sich 
durch die Messung der Absorbtionszunahme genau bestimmen lässt. Durch die 
Verwendung von Antigenlösungen mit bekannter Konzentration in einer 
Standardkurve ist die Konzentration in der Probe berechenbar. Nach dem 
Prinzip des kompetitiven ELISA zeigten die Proben mit der geringsten 
Konzentration an dem zu messenden Protein die höchste Extinktion und die 
Proben mit hohen Konzentrationen entsprechend niedrigere Werte. Die 
Messung der Extinktion erfolgte mit Hilfe eines Plattenphotometers. Das 
Softwareprogramm BioLinx 2.10 (Dynatech, Denkendorf, Deutschland) erstellte 
anhand der gemessenen Extinktionswerte der Standardlösungen eine 
Standardkurve. Je nach ELISA erfolgte eine lineare oder logarithmische 
Auftragung der Extinktion auf der X-Achse und der Konzentration auf der Y-
Achse, um eine lineare oder sigmoidale Standardkurve zu erzeugen. Mit Hilfe 
der durch das Programm erzeugten Standardkurve konnte die Konzentration 
des zu messenden Proteins in der Probe berechnet werden.  

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