Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
17
 
Wirkstoff Dosis/die
L-Arginin 500 
mg
Molsidomin 10 
mg
L-NAME 75 
mg
 
Tab. 2: täglich verabreichte Dosis der Wirkstoffe L-Arginin, Molsdomin und L-
NAME in mg  
 
Der Futterverbrauch und die Trinkwassermenge der Tiere wurde in 
Vorversuchen ermittelt. Die dem Futterteig beigemengten Wirkstoffe basieren 
auf einem täglichen Futterverbrauch von 25 g pro Tier. Für die 
Trinkwassermenge wurde im Vorfeld ein durchschnittlicher Verbrauch von 30 
ml/Tier pro Tag ermittelt. Diese Wirkstoffdosen wurden auf der Basis 
vorausgegangener Experimente von Nierenerkrankungen im Tiermodell der 
Ratte verwendet [62;63;64]. 
2.4 Studienprotokolle 
Es wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Versuchsprotokolle erstellt, die sich 
lediglich in dem Versuchszeitraum unterscheiden.  
2.4.1  Protokoll 1 – Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin 
und L-Arginin + L-NAME sieben Tage nach Induktion der Anti-
Thy-1-Glomerulonephritis 
Die Behandlung der Tiere mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME 
wurde 24h nach Injektion des Anti-Thy-1-Antikörpers - wenn die Mesangialzell-
Lyse abgeschlossen ist und eine fibrotische Gewebeantwort anfängt [65] - 
begonnen. In diesem ersten Studienprotokoll wurden die Tiere sieben Tage 
nach Induktion der Glomerulonephritis getötet. Nach diesem Zeitraum erreicht 
die Matrixakkumulation ihren Höhepunkt und mögliche Effekte einer 
Behandlung können hier am besten betrachtet werden.  

---

 
18
2.4.2  Protokoll 2 – Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin 
und L-Arginin + L-NAME zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-
1-Glomerulonephritis 
Dieses zweite Versuchsprotokoll orientiert sich an Protokoll 1. Auch hier wurde  
24h nach Antikörperinjektion die Therapie begonnen. In diesem ersten 
Studienprotokoll wurden die Tiere zwölf Tage nach Induktion der 
Glomerulonephritis getötet. Nach ungefähr zwölf Tagen dieser 
Glomerulonephritis-Form ist die geschädigte Niere mit Matrixakkumulation und 
Matrixexpansion als Gewebsantwort auf den Verletzungsstimulus über das 
Maximum hinaus. Im Anschluss daran beginnt die Ausheilungsphase. Diese 
zweite Versuchsreihe zum Zeitpunkt der letzten profibrotischen Phase der 
Gewebsantwort wurde gewählt, um eine „second line of evidence“ zu zeigen 
und um die Ergebnisse der ersten Versuchsreihe zu bestätigen.  
Die Aufteilung der Tiere in die vier verschiedenen Therapiegruppen ist in der 
folgenden Tabelle ersichtlich. Diese Aufteilung ist für beide Studienprotokolle 
identisch. 
 
Normale Kontrolltiere
gesunde Kontrolltiere, Injektion mit PBS (n=4) 
GN
Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis, keine Therapie 
(n=12) 
GN-+L-Arg
Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis mit 500 mg L-
Arginin/die (n=12) 
GN+Molsi
Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis mit 10 mg 
Molsidomin/die (n=12) 
GN+Arg-NAME
Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis mit 500 mg L-
Arginin/die + 75 mg L-NAME (n=12) 
 
Tab. 3: Protokoll 1/Protokoll 2; Aufteilung der Tiere in die verschieden 
Therapiegruppen 

---

 
19
2.5 Versuchsparameter 
2.5.1  Messung des systolischen Blutdrucks 
Einen Tag vor der Tötung bzw. dem Ende eines Versuches wurden bei den 
Tieren der systolische Blutdruck gemessen. Die Messung erfolgte mit einem 
Gerät der Firma Life Science Instruments (Woddland Hills/ California, USA). 
Der Blutdruck wurde mit einem aufblasbaren Sensor erfasst, der über den 
Schwanz der Ratte bis ca. 1 cm vor die Schwanzwurzel geschoben wurde. Da 
der Blutdrucksensor sehr empfindlich für Erschütterung war, wurden die Tiere 
während der Messung mit einer leichten Äthernarkose betäubt, ausserdem 
konnte so gewährleistet werden, dass die Tiere nicht durch Stress bedingt 
falsch hohe Werte aufwiesen. Einige Minuten vor und während der Messung 
lagen die Ratten auf einem Heizkissen (Stufe 2), um die Schwanzgefäße, an 
denen die Messung erfolgte, maximal zu weiten. Es wurden jeweils drei Drücke 
gemessen und der Mittelwert ermittelt. 
2.5.2 Urinsammlung 
An dem Tag vor der Nierenentnahme wurden die Tiere in metabolischen 
Käfigen (Metabolic Cage–3701M081 der Firma Tecniplast, Buguggiate, Italien) 
gehalten. Diese Käfige wurden eingesetzt, um den Urin getrennt von den 
restlichen Exkrementen aufzufangen. Über einen speziellen Trichter wird der 
Urin separat gesammelt. Futterreste und Kot fallen in ein weiteres Behältnis. 
Um eine Kontamination des Urins mit Bakterien zu verhindern, wurden dem 
Urinauffanggefäß 100 µl Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml, 10.000 µg/ml) 
hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurden die Tiere in ihre alten Käfige 
zurückgesetzt, die Urinmengen sowie der Trinkwasser- und Futterverbrauch 
wurden notiert. Der Urin wurde mit 5000 U/min für fünf Minuten zentrifugiert und 
der Überstand bei –20°C für die folgenden Messungen eingefroren. 

---

 
20
2.5.3  Entnahme der Nieren 
Zur Nierenentnahme und zur Gewinnung von Serum wurde wie folgt 
vorgegangen: Die Tiere wurden mit einer Äthernarkose betäubt. Die 
Bauchdecke der Tiere wurde mit Alkohol desinfiziert. Anschließend erfolgte 
mittels einer Schere die Eröffnung der Bauchhöhle durch einen U-förmigen 
Schnitt, beginnend einen Zentimeter über dem Penis und an beiden 
Rippenbögen endend. Durch Verdrängung des Darms am Mesenterium nach 
rechts und Eröffnung des dorsalen Peritoneums mittels zweier Pinzetten wurde 
die Bauchaorta präpariert und mit einer 27-Gauge-Butterfly-Kanüle punktiert. 
Mit einer 10 ml Spritze wurde soviel Blut entnommen, bis der Herzstillstand 
eintrat. Über die in der Aorta verbliebene Kanüle wurde nun solange eiskaltes 
PBS mit einer 20 ml Spritze injiziert (ca. 5-7 ml), bis es wieder zu einer 
Herzaktion kam. Anschließend wurden die Vena cava inferior und die Aorta 
abdominalis in Höhe der Leberunterseite oberhalb des Abgangs der 
Nierengefäße mit einer Klemme unterbunden, um ein Zurückfließen von Blut 
aus der oberen Körperhälfte zu verhindern. Anschließend wurde die Vena cava 
abdominalis mit einer Schere eröffnet, um ein Abfließen des infundierten PBS 
zu ermöglichen. Mit den restlichen in der Spritze verbliebenden 15 bis 20 ml 
PBS und einer weiteren 20 ml Spritze PBS wurden die Nieren dann perfundiert. 
Nachdem die Nieren blutleer waren, wurden sie durch einen Schnitt von den 
Gefäßen und dem Ureter getrennt und in ein 50 ml Röhrchen mit 4°C kaltem 
PBS gegeben. Bis zur weiteren Aufarbeitung wurden die Nieren auf Eis 
gelagert. Das entnommene Blut wurde bei 3000 U/min für 10 min bei 4°C 
zentrifugiert. Zur Durchführung weiterer Messungen wurde das Serum 
abpipettiert und bei –20°C eingefroren. 
2.5.4  Aufarbeitung der Nieren, Isolation der Glomeruli für die Zellkultur 
Von den Nieren wurden die Kapsel und das anhängende Fett entfernt und ein 
Fünftel der Niere zur histologischen Aufarbeitung in Formalin (10 %, neutral 
gepuffert) gegeben. Der Rest der Nieren wurde mit einer Klinge längs halbiert 
und das Nierenmark mit einer kleinen Schere herausgeschnitten. Aus den so 

---