Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
27
2.6.2.1 Transforming growth factor-ß ELISA 
Um die Konzentration von TGF-β in unseren Zellkulturüberständen zu 
bestimmen, kam ein „Human TGF-β Immunoassay–Quantikine R“ der Firma 
R&D-Systems (Abingdon, UK) zum Einsatz. Dieser Kit enthielt bereits 
vorbereitete Mikrotiterplatten, die mit einem rekombinantem menschlichen TGF-
β-Rezeptor vom Typ II beschichtet waren. Vor dem Messen in der Platte wurde 
das TGF-β in den Proben aktiviert. Die 250 µl Proben wurden mit 50 µl 1MHCl 
für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 400 U/min 
zentrifugiert. Um den pH-Wert in den Proben wieder zu neutralisieren - eine pH-
Veränderung würde die Messung negativ beeinflussen - wurden 50 µl 1,2M 
NaOH/0,5M HEPES nach dem Zentrifugieren zur Probe hinzugegeben. Der Kit 
enthielt ebenfalls eine Standardlösung (rekombinantes menschliches TGF-β mit 
einer Konzentration von 2000 pg/ml), die nach Verdünnen mit der im Kit 
vorhandenen Lösung RD5l die Konzentrationen von 2000 bis 0 pg/ml ergab. Es 
wurden 200 µl Standard oder aktivierte Probe in die Mikrotiterplatte pipettiert 
und bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach 3 Stunden wurde der 
Inhalt der Platte verworfen und die Platte gewaschen. Anschließend wurden 
200 µl Conjugate-Solution (ein polyklonaler peroxidasegekoppelter Antikörper 
gegen TGF-β) in jede Vertiefung pipettiert und für 1,5 Stunden bei 
Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nachdem der Platteninhalt erneut 
verworfen und die Platte gewaschen wurde, konnte das Substrat in die Platte 
pipettiert und bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert werden. Das Substrat 
bestand aus zwei im Kit enthaltenen Lösungen, Farblösung A (Hydrogen 
Peroxide) und Farblösung B (Tetramethylbenzidine), dem eigentlichen 
Farbstoff. Diese beiden Lösungen wurden im Verhältnis 1:1 kurz vor Gebrauch 
gemischt und anschließend wurden 200 µl pro Vertiefung in die Platte pipettiert. 
Nach 20 Minuten wurde die Reaktion durch Hinzugabe von 50 µl 1M H
2
SO
4
 
gestoppt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450 und 570 nm 
gemessen. Die Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 570 nm 
wurde als Korrekturmessung verwandt. Durch die Subtraktion des bei 570 nm 
gemessenen Werts von dem bei 450 nm gemessenen Wert wurden die 
optischen Interferenzen in der Mikrotiterplatte ausgeglichen. Mit Hilfe der 

---

 
28
Messung der Extinktionswerte für die Standardkurve ließen sich die 
Konzentrationen von TGF-β in den Proben berechnen. Gewaschen wurde 
jeweils mit der im Kit enthaltenen Waschlösung. Diese lag als Konzentrat vor 
und wurde vor der Verwendung 1:25 verdünnt. 
2.6.2.2 Fibronektin ELISA 
Zum Beschichten einer absorbierenden Mikrotiterplatte (F96 Maxisorb der 
Firma Nunc, Wiesbaden) wurde Fibronektin (Fibronectin from rat plasma, F-
0653) im Coating-Puffer, bestehend aus 0,2 g Na
2
CO
3
 und 0,3 g NaHCO
3
 in 
100 ml dH
2
O (ph 9,6), gelöst um eine Zielkonzentration von 200 µg/l zu 
erreichen. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden je 100 µl dieser 
Lösung pipettiert und zwei Stunden inkubiert. Anschließend wurden alle noch 
freiliegenden Bindungsstellen der Platte eine Stunde mit BSA Bovines Serum 
Albumin (BSA) geblockt (10 µg/ml PBST). Nach dem Waschen wurden je 95 µl 
vorbereitete Probe oder Standard pro Vertiefung für eine weitere Stunde 
inkubiert. Zur Vorbereitung wurden die Proben je nach zu erwartender 
Fibronektinkonzentration 1:2 bis 1:8 mit DMEM-Kulturmedium verdünnt, um in 
den linearen Bereich der Standardkurve zu gelangen. Es wurden jeweils 100 µl 
verdünnte Probe oder Standard und 100 µl Primärantikörper (Rabbit/Anti-
Human, Code No A:0245, der Firma DAKO A/S, Dänemark) mit einer 
Konzentration von 45 µg/ml eine Stunde in einer nicht absorbierenden 
Mikrotiterplatte vorinkubiert. Als Standards wurden Fibronektinlösungen mit 
Konzentrationen von 2667; 1334; 667; 333; 167; 83; 42; 21; 10; 5; 3 und 0 
ng/ml eingesetzt. Anschließend wurde erneut gewaschen und eine weitere 
Stunde mit 100 µl Sekundärantikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat 
Anti-Rabbit IgG der Firma Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer 
Konzentration von 0,3 µg/ml pro Vertiefung inkubiert. Nach anschließendem 
Waschen wurden 200 µl der Substratlösung (o-Phenylenediamine 
Dihydrochloride Tablet Set, Code No: P-9187) des Sekundärantikörpers pro 
Vertiefung hinzupipettiert und die Farbintensität mit Hilfe des Platten-
Photometers MRX-5000 bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die 
Konzentration in den Proben konnte wie beschrieben anhand der optischen 

---

 
29
Dichte der Standards ermittelt werden. Die Darstellung und demzufolge die 
Auftragung der Extinktion und der Konzentration erfolgte linear. Die 
Standardkurve zeigte einen sigmoidalen Verlauf. Die Inkubationsschritte und 
das Blocken der gecoateten Platte erfolgten jeweils bei 37°C, dabei wurden die 
Platten mit Folie oder einem Deckel abgedeckt. Gewaschen wurde jeweils nach 
Verwerfen des Inhalts zwei mal mit 400 µl PBST/Vertiefung und zwei mal mit 
200 µl PBST/Vertiefung bei 200 U/min auf dem Minishaker der Firma IKA-
Labortechnik. 
2.6.2.3 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 ELISA 
Der Ablauf des PAI-1-Elisa gleicht dem des Fibronektin-Elisa.
 
Eine 
absorbierende Mikrotiterplatte, Platte 1 (F96 Maxisorb der Firma Nunc, 
Wiesbaden), wurde mit 100 µl PAI-1 (Rat-PAI-1 der Firma American 
Diagnostica Inc., Pfugstadt, Deutschland) in einer Konzentration von 100 mg/ml 
Coating-Puffer beschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 2,5 Stunden wurde 
die PAI-1-Lösung verworfen und die Mikrotiterplatte gewaschen. Anschließend 
wurde die Platte mit 200 µl Blocking-Puffer inkubiert, um unspezifische 
Bindungen der folgenden Antikörper zu verhindern. Der Blocking-Puffer bestand 
aus Bovinem Serum Albumin gelöst in PBST mit einer Konzentration von 5 
mg/ml. Nach einer Stunde Blocken wurde erneut der Inhalt verworfen, 
gewaschen und 95 µl des vorbereiteten Probe-bzw. 
Standardantikörpergemischs in die Platte 1 übertragen. Zur Vorbereitung der 
Proben und der Standards wurden diese 1 Stunde vor Übertragung auf die 
Platte 1 in einer nichtabsorbierenden Mikrotiterplatte  mit dem primären 
Antikörper (Rabbit Anti-Rat PAI-1 IgG der Firma American Diagnostica Inc., 
Pfungstadt, Deutschland) vorinkubiert. Dazu wurden jeweils 100 µl Probe oder 
Standard und 100 µl des Primärantikörpers (Konzentration 1 µg/ml) 
zusammengegeben. Die Proben wurden je nach zu erwartender Konzentration 
1:2 bis 1:5 mit DMEM-Kulturmedium verdünnt. Zur Herstellung einer 
Standardkurve kam das gleiche PAI-1 wie zum Beschichten der Platte 1 zum 
Einsatz. Durch Verdünnen wurden Lösungen mit den Konzentrationen 741; 
445; 267; 160; 96; 58; 35; 21; 12; 8; 5; 3 und 0 pg/µl erreicht. Als der grösste 

---