Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
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Teil des Primärantikörpers die Bindungsstellen für PAI-1 an der Platte oder in 
der Probe besetzt hatte, nach ca.1 Stunde, wurde erneut gewaschen und 
anschließend 1 Stunde mit dem sekundären Antikörper Peroxidase-conjugated 
AffiniPure Goat Anti Rabbit IgG, der Firma Dianova, Hamburg, Deutschland), 
Konzentration 0,3 µg/ml, inkubiert. Nachdem der Sekundärantikörper 
(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG der Firma Dianova, 
Hamburg, Deutschland) an den Primärantikörper gebunden hatte, nach ca. 1 
Stunde Inkubation, wurden nach einem Waschschritt 100 µl des Substrat (o-
Phenylenediamine Dihydrochloride Tablet Set, Code No: P-9187) des 
Sekundärantikörpers hinzupepittiert. Nach 45 Minuten wurde über das 
Plattenphotometer MRX5000 die Menge des entstandenen farbigen Substrat-
Produkts als Absobtion bei 450 nm gemessen werden. Die Konzentration von 
PAI-1 in den Proben wurde wie beschrieben mit Hilfe einer sigmoidalen 
Standardkurve berechnet. Die Auftragung der Extinktion erfolgte ebenso linear 
wie die der Konzentration. Die Inkubationsschritte und das Blocken der 
gecoateten Platte erfolgten jeweils bei 37°C, dabei wurden die Platten mit Folie 
oder einem Deckel abgedeckt. Gewaschen wurde jeweils nach dem Verwerfen 
des Inhalts mit zwei mal 400 µl PBST/Vertiefung und zwei mal 200 µl 
PBST/Vertiefung bei ca. 200 U/min auf dem Minishaker der Firma IKA-
Labortechnik. 
2.6.3 Proteinurie 
Da bei der Urinsammlung in den metabolischen Käfigen die Trennung der 
Exkrementbestandteile nicht ganz sauber erfolgte, war die Gefahr der 
Kontamination mit proteinhaltiger Nahrung relativ groß. Die Bestimmung der 
Proteinurie wäre damit zu unspezifisch für die Abschätzung des 
Krankheitsgeschehens gewesen. Es erfolgte deshalb zusätzlich eine Messung 
der Proteinurie. Zur Bestimmung des Eiweißgehalts im Urin der Tiere wurde die 
Pyrogallol-Rot-Methode in Mikrotiterplatten-Technik [108] (Fluitest USP, 
Pyrogallol-Rot-Methode, Firma Biocon, Vöhl, Deutschland) verwendet. 
Pyrogallol-Rot-Molybdat bilden Komplexe mit anwesenden Proteinen. Diese 
Verbindung erzeugt einen Farbstoff, der einen Absorptions-Anstieg bis zu 600 
nm verursacht. Dieser Absorptions-Anstieg ist direkt proportional zur 

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vorhandenen Proteinkonzentration. Es wurde eine Standardreihe angefertigt, 
wobei 50 µl des Standards mit der Proteinkonzentration von 1 g/l mit NaCl 
verdünnt worden sind, sodass eine Standardreihe von 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 und 1 
g/l Proteinkonzentration entstand. 50 µl des gesammelten 24h-Urins wurden mit 
50 µl NaCl verdünnt. Von diesem Gemisch wurden 10 µl Probe auf eine 
nichtabsorbierende Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurden 350 µl der 
gebrauchsfertigen Pyrolgallol-Rot-Lösung des Herstellers auf die Proben und 
die Standards pipettiert. Nach 10 Minuten erfolgte die Messung der Extinktion 
der Proben/Standards und des Standards mit Hilfe des Platten-Photometers 
MRX-5000 bei 570 nm Wellenlänge. Aus den Extinktionswerten konnte die 
Proteinurie in mg/24h nach unten stehender Formel berechnet werden. 
 
 E (Probe)  * 1000 * Harnvolumen (l) * Verdünnung
 E (Standard)
 
 
Abb. 1: Formel für die Berechnung der Proteinurie in mg/24h 
 
2.6.4 Glomeruläre 
messenger-RNA-Expression von TGF-ß1, 
Fibronektin und PAI-1 
2.6.4.1 Isolation der glomerulären RNA 
Die –80° C gelagerten Proben wurden 5 Minuten in einem Wasserbad 
aufgetaut. Anschließend wurde jeder Probe 200 µl Chloroform hinzugefügt und 
durch vortexen gemischt. Es erfolgte eine dreiminütige Inkubation bei 
Raumtemperatur mit anschließendem Zentrifugieren für 15 Minuten bei 14000 
rpm (Biofuge, Firma Heraeus, Deutschland) und 4°C. In den Proben entstanden 
jeweils drei Schichten, von denen die oberste Schicht (RNA-Schicht) vorsichtig 
in ein neues Tube abpipettiert wurde. Der so gewonnenen RNA wurde 0,5 ml 
Isopropanol hinzugefügt und dieses Gemisch für 10 Minuten bei 
Raumtemperatur inkubiert. Es erfolgte daraufhin eine ebenfalls 10-minütige 
Zentrifugation bei 14000 rpm bei 4°C. Der entstandene Überstand wurde 

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verworfen und das im Tube verbliebene RNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol 
gewaschen und nochmals bei 14000 rpm für fünf Minuten zentrifugiert. Der 
verbleibende Überstand wurde unter Sicht des RNA-Pellets abgekippt und das 
Tube mit dem Pellet fünf Minuten trocknen gelassen. Anschließend wurden je 
Probe 10 µl DEPC-Wasser dazugegeben und die Probe aufgemischt und 
danach bei 60° C für 10 Minuten inkubiert. Zur Konzentrationsbestimmung 
wurde eine Messung der optischen Dichte mit einem Photometer (Firma 
Dynatech, Hamburg, Deutschland) bestimmt, zur Bestimmung der Reinheit der 
gewonnenen RNA wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. 
2.6.4.2  Bestimmung des RNA-Gehaltes und der Qualität 
2.6.4.2.1 Gelelektrophorese 
Zur Bestimmung der RNA-Qualität wurde 1 µl des Probengemisches mit 9 µl 
DEPC-Wasser  und 10 µl Loading Buffer auf ein ethidiumbromidgefärbtes, 
2%iges Agarosegel aufgetragen und für eine Stunde bei 80mA/80V in der 
Gelkammer (Max Submarine Unit, HE 99X, Firma Hoefer, Deutschland) unter 
Mitführung eines 100 bp Markers (Rapidozym, Deutschland) elektrophoretisch 
aufgetrennt. Anschließend wurde die RNA-Qualität unter UV-Licht (254 nm) 
sichtbar gemacht und anhand der Banden beurteilt.  
2.6.5  Konzentrationsmessung der RNA mittels Spektrometer 
Zur Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der gewonnenen RNA 
wurde 1µl der RNA Probe mit 99 µl DEPC-Wasser verdünnt und im Photometer 
(Firma Dynatech, Hamburg, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 260 nm 
die Extinktion für Nukleinsäuren gemessen. Das hier verwendete Spektrometer 
mißt selbständig den Quotienten zwischen DNA- und RNA-Extinktion, um zu 
überprüfen, ob in der Probe eventuell Spuren von DNA enthalten sind, und gibt 
eine Ratio an. Eine Ratio zwischen 1,4 und 1,6 wurde als qualitativ gut und rein 
bewertet. Aus der ermittelten Extinktion der RNA bei 260 nm wurde die 
Konzentration der RNA in µg/ml nach folgender Formel berechnet:  

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