Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
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E * f * 40
=   RNA
1000
 
 
Abb. 2: Formel für die Berechnung des RNA-Konzentration in µg/ml 
 
Diese Werte wurden der folgenden RT-PCR zu Grunde gelegt. 
2.6.6  RT-PCR 
Die PCR ist eine etablierte Methode zur Genanalyse, die es ermöglicht, auch 
kleine Mengen von DNA zu untersuchen. Von dem zu untersuchenden 
Genabschnitt werden eine so hohe Anzahl von Kopien angefertigt, so dass das 
Amplifikat analysierbar wird. Die PCR beruht auf drei wesentlichen Schritten. 
Als erstes wird die DNA so stark erhitzt, dass sich die beiden Doppelstränge 
von einander trennen. Dieser Schritt heißt Denaturierung. Anschließend wird 
die Reaktionstemperatur soweit gesenkt (annealing temperature), dass sich vor 
bzw. hinter dem zu untersuchenden Genabschnitt jeweils individuelle 
Primerpaare anlagern können. Primer sind Oligonucleotide, die etwa 15-30 
Basenpaare umfassen und als Starthilfe für die Synthese des komplementären 
Strages benötigt werden. Sie flankieren jeweils die gewünschte Region in der 
Ziel-DNA. In dem dritten Arbeitsschritt wird die Temperatur auf den otimalen 
Arbeitsablauf der in die Reaktion eingebrachten DNA-Polymerase eingestellt, 
die eine komplementäre Kopie des Bereiches zwischen den beiden 
Primerpaaren anfertigt. Anschließend beginnt der Zyklus von neuem mit der 
Denaturierung. Dieses Vorgehen ermöglicht eine Verdopplung des 
Gensegments bei jedem Zyklus. 
Die hier verwendete RT-PCR ist eine gängige Methode zu Untersuchung von 
messengerRNA-Genexpression. Durch das Enzym Reverse Transkriptase (RT) 
wird die isolierte RNA in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben, da die 
RNA selbst für die PCR nicht thermostabil genug ist.  

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2.6.6.1 Reverse Transkriptase-Reaktionen 
Die isolierte RNA wurde auf eine Konzentration von 1 µg/µl eingestellt und mit 
einer Lösung aus 4 µl Magnesiumchlorid, 2 µl PCR-Puffer, 2 µl DEPC-Wasser, 
jeweils 2 µl der Desoxynukloesidphosphaten von Adenin (dATP), Guanin 
(dGTP), Cytosin (dCTP) und Thymidin (dTTP), 1 µl des unspezifischen Primer 
Random Hexamer, 1 µl des RNAse Inhibitors und 1 µl der Murinen Reversen 
Transkriptase versetzt (alle verwendeten Substanzen analog Hersteller des RT-
Kits RNA PCR Core Kit, PE Applied Biosystems,  California, USA). Dieser 
Ansatz wird 10 Minuten bei 25°C, 45 Minuten bei 42°C, 5 Minuten bei 95°C und 
weitere 10 Minuten bei 0°C im Thermocycler (Trio-Thermoblock, Biometra, 
Deutschland) inkubiert.  
2.6.6.2 PCR 
Für die PCR wurde die bei der RT erzeugte cDNA verwendet. Es wurde die 
relative Menge an cDNA der Gene für TGF-ß, Fibronectin und PAI-1 bestimmt, 
die eine Aussage darüber erlaubte, wieviel mRNA für das jeweilige Gen in der 
RNA-Probe enthalten war. Zusätzlich wurde eine semiquantitave Auswertung 
von Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) durchgeführt. Dieses 
Gen gehört zu den sogenannten „housekeeping enzymes“ und wird 
definitionsgemäß in der immer gleichen Menge exprimiert. Es stellt somit als 
Maß dafür, wie erfolgreich die RT verlaufen und wieviel cDNA in den einzelnen 
Proben jeweils vorhanden war. Die PCR (Polymerase-Chain-Reaction) beginnt 
grundsätzlich mit einer Denaturierung doppelsträngiger DNA zu jeweils zwei 
Einzelsträngen bei einer Temperatur von 95°C. Als zweiter Schritt erfolgt eine 
Hybridisierung von im Überschuß vorliegenden Oligonucleotiden, sogenannten 
Primern, an ihre komplementären Sequenzen bei einer Temperatur von 59°C 
(für GAPDH) und 64°C (für die Zytokine TGF-ß, PAI-1 und Fibronektin). Dieser 
Schritt wird auch als „Annealing“ bezeichnet. Als Drittes kommt es bei einer 
Temperatur von 72°C zu einer komplementären Verlängerung der Einzelstrang-
DNA zum Doppelstrang durch die DNA-Polymerase, die die Primer als 
Startsignale für diesen Vorgang erkennt. Diese drei Zyklusschritte werden zur 

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Vervielfältigung, der Amplifizierung, der Ziel-DNA bis zu 29 Mal wiederholt. Die 
Zyklenzahl ist Primer-abhängig, ebenso wie die „annealing-temperature“ und ist 
aus der Tabelle 5 ersichtlich. 
Die cDNA-Probe wurde mit einer Lösung aus Magnesiumchlorid, PCR-Puffer, 
den jeweiligen Primer-Paaren und der DNA-Polymerase versetzt und nach dem 
oben erläuterten Prinzip der PCR amplifiziert.  

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GAPDH TGF-ß1 
PAI-1 Fibronektin 
Sense 
1,5 µl 
1,5 µl
1,5 µl 
1,5 µl
 
CCATCTTCC GGTGGCAGGC
CAGCATGTGG 
GGTCCAAATCG
 
AGGAGCGAGAT GAGAGCGCTGA TCCAGGCCTCCAAA GTCATGTTCCCA
Antisense 
1,5 µl 
1,5 µl
1,5 µl 
1,5 µl
 
GATGACCTTG GGCATGGTAG
TGTGCCGCTC GCCCCAGGTC
 
CCCACAGCCT CCCTTGGGCT TCGTTCACCTCGAT
CT 
TGCGGCAGTTGT
cDNA 
1µl 1µl
1µl 
1µl
10fach TBE-
Puffer 
2 µl 
2 µl
2 µl 
2 µl
Mg-Cl 
2 µl 
2 µl
2 µl 
2 µl
dNTP 
0,1 µl 
0,1 µl
0,1 µl 
0,1 µl
DEPC-H2O 
11,65 µl 
11,65 µl
11,65 µl 
11,65 µl
Temperatur-
Profil 
24 Zyklen 
27 Zyklen
27 Zyklen 
27 Zyklen
 
95°C für 10:00 min 
95°C für 10:00 min
95°C für 10:00 min  95°C für 10:00 min
 
94°C für 00:30 min 
94°C für 00:30 min
94°C für 00:30 min  94°C für 00:30 min
 
59°C für 00:30 min 
64°C für 00:30 min
64°C für 00:30 min  64°C für 00:30 min
 
72°C für 02:00 min 
72°C für 02:00 min
72°C für 02:00 min  72°C für 02:00 min
  
72°C für 07:00 min 
72°C für 07:00 min
72°C für 07:00 min  72°C für 07:00 min
  
 4°C für 10:00 min 
 4°C für 10:00 min
 4°C für 10:00 min   4°C für 10:00 min
 
Tab. 
4: 
 
PCR-Protokolle für GAPDH, TGF-ß, Fibronektin und PAI-1: 
Sense/Antisense-Sequenzen, Temperaturprofile und Zykluslängen 
 
Anschließend wurde der Probe 8 µl Ladungspuffer (bestehend aus 20% 
Glycerol, 0,02% Bromphenolblau und DEPC-Wasser) zugesetzt und das 
Gemisch auf ein 1%iges mit Ethidiumbromid versetztes Agarosegel 
aufgetragen. Unter Mitführen eines 100 bp Markers (Rapidozym, Berlin, 
Deutschland) wurde das Amplikon bei 125 Volt 35 Minuten elektrophoretisch 
aufgetrennt, wonach die DNA-Banden unter UV-Licht (254 nm) durch 
Interkalation der DNA mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden. Dieses Gel 
wurde anschließend durch einen bildgebenden Dichtemesser (Typhoon® 8600, 
Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) und mit dem 
Programm „ImageQuant®“ (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, 

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