Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
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Deutschland) semiquantitativ die Banden des Zielgens (TGF-ß, PAI-1, 
Fibronektin) im Vergleich zum housekeeping enzyme GAPDH analysiert. Die 
Werte der Dichtemessung für TGF-ß1, PAI-1 und Fibronektin wurden durch die 
Dichtewerte von GAPDH dividiert. Diese Ratio Zielgen/GAPDH wurde 
tabellarisch aufgetragen. Für das Zielgen wurde bei den unbehandelten 
nephritischen Tieren (GN) für die Bestimmung der Quantität der glomerulären 
Zytokin-Expression ein Wert von 100% angenommen. 
2.7 Nitrat/Nitrit-Messung (Griess-Assay) 
Nitrat und Nitrit sind die stabilen Oxidationsprodukte des NO. Sie fungieren als 
Indikatoren der endogenen NO-Synthese [38]. Für die Messung dieser 
Indikatoren diente die Reaktion nach Griess [10]. Die Sensitivität dieser 
Reaktion erhöht sich, wenn vor der Messung mittels Reduktase Nitrat zu Nitrit 
reduziert wird [69]. Analysiert wurden Plasma- und Urinproben der Tiere. Beide 
Probenarten wurden zuerst mit PBS verdünnt. Die Urinproben wurden im 
Verhältnis 1:10, die Plasmaproben wurden im Verhältnis 1:3 mit PBS verdünnt. 
Anschließend wurde 100µl Probenvolumen entnommen und jeweils 40 µl 0,05 
mmol/L NADPH (Nicotinamidadenindinucleotidphosphat) und 30 µl 0,05 U des 
Enzyms Nitrat Reduktase (Boehringer Mannheim Biochemie, Mannheim, 
Deutschland) in die Urin- und Plasmaproben dazugegeben. Es erfolgte eine 
45minütige Inkuabtionszeit bei bei Raumtemperatur. Ausgangssubstanz für die 
Standardkurve war eine 1M Natriumnitrit – Lösung, die zu einer 100 µM Lösung 
mittels PBS verdünnt wurde. Durch weitere Verdünnung mit PBS erreichte man 
verschieden Konzentrationen von 0; 1; 2; 5; 5; 7; 10; 15; 20; 25; und 50 µM 
Natriumnitrit, die dann als Standard-Proben fungierten. 100 µl dieser Standard-
Proben wurden ebenfalls mit 30 µl 0,05 U des Enzyms Nitrat Reduktase 
(Boehringer Mannheim Biochemie, Mannheim, Deutschland) versetzt. Nach 
Ablauf der Inkubationszeit wurden die Urin- und Plasmaproben mit 20 µl einer 
70%igen Zinksulfat-Lösung versetzt und bei 14.000 U für fünf Minuten 
zentrifugiert. Daraus resultiert eine Proteinfällung, die die Sensitivität der 
Messung erhöht, da noch vorhandene Eiweiße die optische Dichtemessung 
stören können. 100 µl der Proben und der Standard-Proben wurde auf eine 
nichtabsorbierende Mikrotiterplatte 
 
aufgetragen und anschließend auf jede 

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Probe 100 µl Griess-Reagenz  pipettiert. Griess-Reagenz besteht aus zwei 
gleichen Anteilen Griess-I-Lösung (0,05% N-(1-naphtyl)ethylendiamin-
Dihydrochlorid) und Griess-II-Lösung (0,5% Sulfanilamid in 45% eiskalter 
Essigsäure), die erst unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Urin- und 
Plasmaproben, zur Griess-Reagenz zusammengemischt werden. Dann erfolgt 
eine 10minütige Inkubation in Dunkelheit. Bei 570 nm konnte mittels des 
Plattenphotometer MRX5000 (Dynex Technologies, Frankfurt am Main, 
Deutschland) die Menge des entstandenen farbigen Substrat-Produkts als 
Absobtion gemessen werden. Die Konzentration in den Proben wurde anhand 
der optischen Dichte der Standards ermittelt.  
2.8 
Effekte des NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion in vitro 
Um die direkten Einflüsse von NO auf die Produktion des Zytokins TGF-ß in 
vitro zu untersuchen, wurden Glomeruli von zwei normalen, gesunden Tieren 
und Glomeruli von drei unbehandelten, nephritischen Tieren, (Tag sieben nach 
Injektion des OX-7 Antikörpers in einer Dosis von 0,5 mg/kg KG) in DMEM 
Kulturmedium bei einer Dichte von 2000/ml resuspendiert. Der NO-Donor 
Diethylenetriamin (Halbwertszeit bei 37°C: 20 h; DETA NONOate, Cayman 
Chemical, Ann Arbor, MI USA) wurde in ansteigenden Konzentration diesen 
kultivierten Glomeruli zugesetzt: 0 (Kontrolle), 10, 50, 100, 500 µmol/l. diese 
Konzentrationen wurden auf Grundlage vorangegangener Arbeiten gewählt 
[103]. Anschließend wurden die Glomeruli 48 Stunden bei 37°C/5% CO2 
inkubiert. Danach wurden der Überstand gesammelt und bei – 20° C bis zur 
Analyse der TGF-ß-Produktion gelagert. Es wurden jeweils drei Proben von 
jedem Tier analysiert. Die TGF-ß-Produktion wurde wie oben beschrieben 
anhand des TGF-ß-ELISA analysiert. 

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2.9 Statistische 
Auswertung 
Die Versuchsergebnisse wurden je Gruppe als Mittelwert ± 
Standardabweichung dargestellt. Die Auswertung wurde mit dem SPSS 
Software-Programm vorgenommen. Die statistische Analyse erfolgte unter 
Verwendung einer ANOVA-Prozedur und anschließendem t-Test mit Bonferroni 
Korrektur für Mehrfachtestung. Ein p-Wert von <0,05 wurde als signifikant 
gewertet. Die Daten der mRNA-Exprimierung wurden mit Man-Whitney-U-Test 
ausgewertet. 

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3 Ergebnisse 
3.1 Protokoll 
1 
 
Effekte der Behandlung mit L-Arginin, 
Molsidomin und L-Arginin + L-NAME sieben Tage nach Induktion 
der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis 
3.1.1 Gewichtsverhalten 
Bis zum Tag der Nierenentnahme erreichten die Versuchstiere folgendes 
Gewicht: 
 
Gruppe 
Gewicht in g
Gesunde Kontrollen 
265 ± 24
GN 
259 ± 23
GN-Arg 
267 ± 25
GN-Arg-NAME 
268 ± 20
GN-Molsi 
245 ± 11
 
Tab. 5: Mittleres Körpergewicht in g der Gruppen in Versuchsprotokoll 1; In der 
ANOVA-Prozedur zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei den 
Gewichten der einzelnen Gruppen. P=NS für alle Gruppen 
 
3.1.2  Aufgenommene Dosen von L-Arginin, Molsidomin und L-NAME 
Über den täglich dokumentierten Futter- und Trinkwasserverbrauch wurden die 
tatsächlich aufgenommenen Medikamentendosen mg/Tier/Tag berechnet. 
3.1.2.1 L-Arginin 
Alle Tiere wurden mit dem oben beschriebenen Futter gefüttert. Da das Futter 
per se einen L-Arginin-Anteil von 0,87% enthält, ist die Menge an 
aufgenommenen L-Arginin höher, als die täglich dazugegebene Dosis.  

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