Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
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gewonnenen vier Nierenhälften wurden durch ein Siebverfahren die Glomeruli 
isoliert. Dazu wurden die Nierenhälften auf einer Glasplatte, welche auf Eis, lag 
mit Hilfe einer Klinge zerkleinert. Der so entstandene Gewebebrei wurde auf ein 
Metallsieb (Maschengröße 160 µm) übertragen und unter Zuhilfenahme eines 
Glasspatels durch die Maschen des Siebes gepresst. Während des 
Durchpressens des Nierengewebes wurden die mit Gewebe gefüllten Poren 
des Siebes immer wieder mit PBS freigespült. Das sich auf dem nächsten Sieb 
(Maschengröße 125 µm) sammelnde Gewebe wurde mit einem kräftigen Strahl 
PBS aus einer Spritzflasche (250 ml der Firma Nalgene) zusammengetrieben 
und ca. 2 min kräftig durchgespült. Das auf dem anschließenden Sieb, 
Maschenweite 90 µm, aufgefangene Gewebe wurde mit Hilfe der Spritzflasche 
auf das nächste Sieb mit einer Maschenweite von 71 µm übertragen und mit ca. 
300 ml PBS indirekt gespült, um die Glomeruli von den kleinen 
Gewebstrümmern zu reinigen. Die so gewonnenen Glomeruli wurden in ein 
steriles 50 ml Röhrchen der Firma Nunc übertragen und für 10 min bei 15000 
U/min bei 4°C zentrifugiert. Die Siebe, die Glasspatel, die Glasplatten, die 
Klingen, die Scheren und Pinzetten wurden vor der Benutzung bei 120°C für 90 
Minuten sterilisiert. Das PBS wurde vor der Verwendung autoklaviert, ebenso 
wie die Spritzflaschen und die Becher, auf denen die Siebe während der 
Isolation der Glomeruli ruhten. Die Siebe, Glasspatel , Glasplatten, Klingen, 
Scheren, Pinzetten und das PBS wurden nach der Sterilisation vor der 
Benutzung auf eine Temperatur von 4°C gekühlt. 
2.5.5 Zellkultur 
Nach dem Zentrifugieren wurden der Überstand verworfen und die Glomeruli in 
5 ml Zellkulturmedium resuspendiert. Als Zellkulturmedium wurde  DMEM 
(Dubecco´s modified Eagle Medium) unter Zusatz von 0,1 U/ml Insulin, 100 
U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin und 25 mM HEPES-Puffer verwendet. 
Durch Auszählung von 10 µl der resuspendierten Glomeruli unter dem 
Mikroskop wurde die Anzahl der Glomeruli bestimmt, welche durch das Sieben 
von jedem Tier gewonnen wurde. Nach dreimaliger Wiederhohlung der 
Auszählung wurde der Mittelwert gebildet und die Konzentration der Glomeruli 
für jedes Tier auf den gleichen Wert (ca. 2000 Glomeruli/ml) durch Zugabe von 

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entsprechenden Mengen Medium eingestellt. Von jedem Tier wurden 3 Kulturen 
von je 1 ml in einer 24-Loch-Zellkulturplatte angelegt und in einem Brutschrank 
bei 37°C und 5% CO
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 kultiviert. Nach 24 und 48 Stunden wurden die 
Zellkulturüberstände auf Bakterien- und Pilzwachstum überprüft. Nach 48 
Stunden wurden sie abgeerntet und nach Zentrifugation mit 5000 U/min für 5 
Minuten bei 4°C nochmals abpipettiert und bei –20°C bis zu weiteren 
Messungen eingefroren.  
2.6 
Messung der Krankheitsparameter 
Zur Abschätzung der Effektivität der unterschiedlichen Therapien wurde neben 
dem morphologischen Parameter der Histologie und dem funktionellen 
Parameter der Proteinurie ebenfalls eine Zellkultur von den Glomeruli der 
Versuchstiere anlegt. Im Überstand der Zellkultur wurden TGF-β, Fibronektin 
und PAI-1 bestimmt, da die Expression dieser Proteine mit dem Ausmaß des 
Krankheitsgeschehens korreliert. Zur quantitativen Bestimmung von TGF-β, 
Fibronektin und PAI-1 konnte die ELISA-Technik genutzt werden. Die 
messenger-RNA-Expression dieser Fibroseparameter wurde mit einer RT-
Polymerase-Kette-Reaktion (RT-PCR) analysiert. Als Indikatoren für die 
endogene NO-Synthese wurden Nitrat/Nitrit-Messungen mittels Griess-Reaktion 
bestimmt. Um die Effekte einer direkten NO-Donation auf glomeruläre Zellen in 
vitro zu untersuchen, wurde der NO-Donor Diethylenetriamin (DETA) 
(NONOate) auf gewonnene Glomeruli gegeben und im Überstand die TGF-ß-
Produktion mittels ELISA bestimmt. Die histologische Auswertung erfolgte nach 
einer HE- und PAS-Färbung mikroskopisch mit Hilfe eines Scores-Systems.  
2.6.1 Histologie 
2.6.1.1  Einbettung und Anfertigung der histologischen Schnitte 
Das bei der Nierenentnahme gewonnene Gewebestück wurde bis zur 
Weiterverarbeitung in Formalin belassen. Innerhalb von 12 Stunden wurden die 
so konservierten Gewebestücke weiterverarbeitet. In einem Einbettautomaten 

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erfolgte zunächst die Auswaschung des Fixiermediums, dann über ein 
Zwischenmedium die Durchtränkung des Gewebes mit Paraffin. Das so 
vorbereitete Gewebe wurde mit Hilfe von Metallwännchen in kleine 
Paraffinblöcke gegossen, welche mit den beschrifteten Deckeln der Histokinette 
abgedeckt wurden. Nach Aushärten der Blöcke auf einer Kühlplatte wurden mit 
dem Schlittenmikrotom HN 40 der Firma Reichert-Jung 3 µm dicke 
Paraffinschnitte angefertigt. Diese wurden in einem Wasserbad (25°C) 
aufgefangen, anschließend auf Objektträger übertragen und in einem warmen 
Wasserbad (46°C) gestreckt. Zur Trocknung wurden die Objektträger für 24 
Stunden bei 37°C in einem Wärmeschrank gelagert. 
2.6.1.2  Histologische Färbungen  
Es wurde eine Färbung mit Perjodsäure-Schiff-Reagenz (PAS) und eine 
immunhistochemische Anfärbung des Fibrosemarkers TGF-ß1 durchgeführt.  
2.6.1.2.1 PAS-Färbung 
Bei der PAS-Färbung kommt es zu einer deutlichen Anfärbung der 
extrazellulären Matrix, was eine quantitative Einschätzung ermöglicht. Die HE-
Färbung diente zur Kontrolle der in der PAS-Färbung gesehenen Strukturen. Da 
die Farbstoffe nur wasserlöslich waren, mussten die Gewebeschnitte zum 
Färben vom Paraffin befreit werden. Dazu wurden die Objektträger zunächst 
zwei mal 5 Minuten in Xylol 100% gebracht und anschließend jeweils kurz 
durch eine absteigende Alkoholreihe (Ethanol 96%, 96%, 80%, 50%, Aqua 
dest. und Aqua dest.) gezogen. Die so entparaffinierten Schnitte wurden nun für 
10 Minuten in 1%ige Perjodsäure gestellt und anschließend 5 Minuten in 
Leitungswasser gespült. Dann wurden die Schnitte, nachdem sie kurz in 
Schwefelwasser getaucht wurden, für 20 Minuten in Schiff-Reagenz gestellt und 
abermals kurz in Schwefelwasser getaucht. Nach 10 Minuten Spülen mit 
Leitungswasser erfolgte für 10 Minuten die Gegenfärbung mit Hämalaun und 
anschließend erneutes Spülen in Leitungswasser für 10 Minuten. Die so 
gefärbten Schnitte wurden durch eine aufsteigende Alkoholreihe (Aqua dest., 
Aqua dest, 50% Ethanol, 80%, 96%, 96%, 100%, 100% und 100%) wieder 

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